共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究では、金属ナノ構造の「光誘起熱」を積極的に活用し、新奇な高温ナノ科学を創成することを目的とした。とくに、試料表面上の微小領域における新奇な熱物性を見出し、そのメカニズムを解明することを主たる目的とした。白色光照射下で金属薄膜表面の暗視野顕微分光測定を行い、レーザー照射下におけるプラズモン共鳴波長の変化を観察した結果、数度程度の温度変化を共鳴波長の変化として検出できることが明らかになった。さらに、光発熱した金属ナノ構造表面と吸着分子との相互作用をナノ分光学的に解明した。

酵素活性部位のタンパク質分子空洞が示す直鎖アルカン認識機能に影響を及ぼす空洞の分子構造を明らかにするため，鉄含有メタン酸化酵素、銅含有メタン酸化酵素、アンモニア酸化酵素、シトクロムP450BM-3による直鎖アルカンからアルコール異性体への選択性を明らかにした．これら酵素の生成物選択性と活性点分子構造から、空洞容積と空洞表面を形成するアミノ酸側鎖の種類が、活性点への直鎖アルカンの分子配向認識に大きく影響を及ぼすことを示した。

本研究では、量子化学計算により求めたトリペプチドの電子状態情報から、トリペプチドの生体内活性酸素種に対する抗酸化活性、およびアルツハイマー病といった疾患予防に寄与する電子状態情報を明らかにすることをめざす。 そのため本研究計画では、種々トリペプチドについて、抗酸化活性測定、量子化学計算による電子錠情報解析、マウスを用いた疾患予防効果の分析を行う。研究初年度の2021年度は、トリペプチド7種についてヒドロキシラジカルに対する抗酸化活性を測定し、その活性を定量的に評価した。平行してマウス実験準備を進めた。 抗酸化活性の測定結果から、選択したトリペプチドは抗酸化活性が高いものから活性がないものまで段階的に異なっていることを明らかにした。これらトリペプチドについて量子化学計算を行い、トリペプチドの分子軌道とそのエネルギー、電荷分布をもとめた。これら電子状態情報とトリペプチドの抗酸化活性との相関性を調べた結果、トリペプチドにおいて電子が占有している分子軌道のうち最もエネルギーが高い軌道である最高被占軌道（HOMO）が抗酸化活性との間に相関性があることを見いだした。また、イオン化ポテンシャルとの間にも相関性があることを見いだした。さらに、トリペプチド末端のかさ高さが抗酸化活性に影響を及ぼす可能性が示唆された。これら電子状態情報および分子構造特性が、トリペプチドの抗酸化活性ならびに疾患予防効果の予測指標として利用できる可能性が高い。

本研究では、メタンからメタノールへの酸化反応に活性な銅含有メタン酸化酵素における高酸化活性種生成の制御機構に関わる、銅含有メタン酸化酵素触媒部位への電子伝達経路を特定することを目的とした。単核銅欠損型メタン酸化酵素の調製方法を確立した。この酵素のメタンからメタノールへの酸化反応への活性は、電子供与体に依存した。この結果から、銅含有メタン酸化酵素の単核銅部位が、細胞膜内の電子伝達系から電子を受容していることを明らかにした。すなわち、細胞膜内の還元型キノンから単核銅を経由して、触媒中心である二核銅へと電子が供与されることが明らかになった。

石油代替炭素資源である天然ガス主成分のメタンからメタノールを合成するプロセスは、メタノールが燃料あるいは種々の化学製品の原料となるため、特に重要である。本課題では、メタンをメタノールに直接変換する触媒として利用できる生体触媒、膜結合型メタン水酸化酵素(pMMO)を大量に調製することをめざす。特に本課題では、pMMOのうちメタン-メタノール転化反応にかかわる活性部位領域を含むドメインのみを大量調製する方法を確立する。

酵素銅含有メタンモノオキシゲナーゼ(pMMO)と酵素メタノールデヒドロゲナーゼ(MDH)との複合体を用いることで、pMMOによるメタンからのメタノール生成反応が長時間進行する要因を明らかにした。過酸化水素は、電子供与体から電子を受容するpMMOの銅イオンを酸化し、pMMOを阻害する。MDHのpMMOへの結合により、過酸化水素はpMMOの銅イオンに過酸化水素が接近できない。そのため、pMMOによる酵素反応は長時間進行する。

本研究課題では、(1)膜結合型メタン水酸化酵素(pMMO)と複合体を形成し、pMMOを安定化するタンパク質pMMO-Rの構造と機能を特定し、(2)pMMO-RによるpMMO活性安定化機構を明らかとすることをめざしている。 平成19年度は、上記(1)を達成するため以下3つの実験を行った。(1)pMMO-Rの単離精製(2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定(3)アミノ酸配列から推測されるタンパク質活性の測定。 (1)pMMO-Rの単離精製:メタン酸化細菌を培養し、得られた菌体から各種カラムクロマトグラフィーを用いてpMMO-Rの単離精製を行った。ゲル濾過カラムおよび陰イオン交換カラムによる精製の諸条件を検討し、pMMO-Rを高純度に精製することに成功した。 (2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定:pMMO-Rのアミノ酸配列は、メタン酸化細菌由来のメタノール脱水素酵素(MDH)と同じであった。 (3)タンパク質活性の測定:pMMO-RのMDH活性を確認するため、紫外可視吸光光度計を用いてメタノール酸化活性を測定した。その結果、pMMO-Rはメタノール酸化活性を示すことがわかった。 以上の結果から、pMMO-Rは既知タンパク質であり、メタノール酸化活性を示すMDHであることがわかった。これまでに報告されているMDHの構造・機能に関する知見を加味して、MDHがpMMOと複合体を形成することで、如何にしてpMMO活性を安定化しているのかを明らかとすることが今後の課題である。

未来型資源といわれるメタンやメタノールなどのC1化合物を単一炭素源として生育可能なC1微生物を研究対象とし、高濃度メタノール生育能付与や転写スイッチの利用といった代謝改変と制御により、C1化合物を原料にしたものづくりの基盤を構築することを目的としている。 2023年度は、2022年度までに取得していたMethylorubrum extorquensの高濃度メタノール耐性実験室進化株の全ゲノムリシーケンスの結果から責任遺伝子を予想し、解析を進めた。実験室進化株に見出された変異を実験室進化の親株に導入し、高濃度メタノール添加条件下で培養した。その結果、親株と比較して良好な生育能を示したが、その生育速度は実験室進化株より顕著に遅く、高濃度メタノール耐性への寄与は部分的であることが示された。得られた実験室進化株について、高濃度メタノール添加条件で培養し、物質生産のターゲットとしている微生物産生生分解性プラスチック、ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の蓄積量を測定したところ、親株と比較して2倍程度増加していた。 また、2022年度までに構築したM. extorquens代謝改変株を宿主として、PHAモノマー前駆体を供給する酵素遺伝子発現のタイミングを転写スイッチを用いて検討した。培養開始時に当該遺伝子の発現を誘導したところ、生育が著しく阻害された。一方で、生育後に誘導した際には、PHAの第二、第三モノマー分率が非誘導の株と比較して5倍程度増加していた。今後、実験室進化株内で同様に転写スイッチによるPHAモノマー分率の制御を行う予定である。

メタン変換バイオ触媒はメタン-メタノール変換プロセスを大幅に省エネルギー化し、CO2 排出量を抑制できる。本研究ではメタン変換バイオ触媒の性能に有機無機ハイブリッドコーティングが及ぼす影響を明らかにし、このコーティング法を応用したメタン変換バイオ触媒が社会実装可能な性能を示すかどうかを検証する。本手法の有効性を実証することで、常温常圧，一段階での省エネ型メタン変換プロセスの実現に向けた研究展開をめざす。 2023年度は、高分子電解質としてポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（PDADMAC）、金属酸化物として酸化ケイ素（SiO2）を用いたメタン変換バイオ触媒表面へのコーティング手法を検討した。メタン酸化バイオ触媒であるバクテリア細胞を培養し、このバクテリア細胞へ種々の条件（PDADMAC や TMOS 濃度、処理時間、温度）でPDADMACとSiO2を順に吸着させることで、コーティング状態の異なるバイオ触媒を調製した。得られた種々メタン変換バイオ触媒について、メタンからメタノールへの転化反応に対する触媒活性と寿命を評価した。その結果、SiO2はメタン酸化バクテリアのメタノール生産性能に影響を及ぼさないのに対して、PDADMCはその性能を低下させる効果を示した。そこでさらに、PDADMAC濃度や吸着溶液のpH、ならびに処理時間や分離方法を検討した。その結果、メタノール生産性能をほぼ維持した状態でメタン酸化バクテリア細胞表面をPDADMACおよびSiO2でコーティングできる条件を見出すことに成功した。

本研究では、常温常圧での直鎖アルカン酸化反応において炭素鎖末端へ位置選択的にヒドロキシル基を導入することで、選択的に第一級アルコールを合成する酵素触媒の創製をめざす。 平成３０年度において調製した直鎖オクタンから1-オクタノールを選択的に得られる酵素について、２か所のアミノ酸側鎖（アラニン328、アラニン82への置換）をトリプトファンに置換することでさらに選択性が増大し、２１％の選択性で1-オクタノールが得られることを明らかにした。このアミノ酸側鎖置換影響をさらに調べるため、令和元年度は２か所のアミノ酸側鎖に種々のアミノ酸側鎖を導入し、それら置換が1-オクタノールへの選択性に及ぼす影響を調べた。その結果、1-オクタノールへの選択性は導入するアミノ酸側鎖の分子体積に依存することがわかった。この依存性から、1-オクタノールヘの選択性が最も高いのは分子体積のもっとも大きなトリプトファンを導入した場合であることがわかった。このことは、さらに1-オクタノールへの選択性を増大させるためには、アラニン328、アラニン82以外のアミノ酸側鎖への置換が必要であることを示唆している。そこで、in silicoでアミノ酸側鎖を置換した酵素モデルを用いてAutodockによるドッキングシミュレーションを行った。その結果、1-オクタノールへの選択性を高める可能性がある２か所のアミノ酸側鎖を見出した。 一方、直鎖オクタンより炭素数の小さい直鎖アルカンの酸化反応における生成物選択性を明らかにするため、直鎖ヘキサン酸化反応を行った。その結果、直鎖オクタン酸化反応の場合とは異なり、直鎖ヘキサン酸化反応では2-ヘキサノールへの選択性が高くなることがわかった。これは、直鎖アルカンの炭素数をオクタンより小さくすることで、さらにアミノ酸側鎖の置換部位とその種類の検討を要することを示唆している。