Research projects

We developed a novel optical technique to elucidate the photothermal effect of metallic (plasmonic) nanostrucutures. Dark-field optical spectroscopy enabled us to determine surface temperature of the laser-illuminated metallic nanostructures. We also investigated the photothermal interactions of the metallic nanostructures with adsorbed organic molecules with the use of surface-enhanced Raman spectroscopy. These results have opened a new window in high temperature sciences.

Regio- and enantioelectivities for alcohol isomes from n-alkanes by soluble methane monooxygenase, particulate methane monooxygenase, ammonia monooxygenase, and cytochrome P450 BM-3 were measured for investigating the influence of cavity structure of enzymic active site on n-alkane recognition at the active site. From the selectivity, orientation of n-alkanes at the active site of enzymes was determined. According to the active site structure of the enzymes used here, we revealed that n-alkane recognition was dependent on the volume of active site cavity and the properties of amino acid residues composing the cavity.

本研究では、量子化学計算により求めたトリペプチドの電子状態情報から、トリペプチドの生体内活性酸素種に対する抗酸化活性、およびアルツハイマー病といった疾患予防に寄与する電子状態情報を明らかにすることをめざす。 そのため本研究計画では、種々トリペプチドについて、抗酸化活性測定、量子化学計算による電子錠情報解析、マウスを用いた疾患予防効果の分析を行う。研究初年度の2021年度は、トリペプチド7種についてヒドロキシラジカルに対する抗酸化活性を測定し、その活性を定量的に評価した。平行してマウス実験準備を進めた。 抗酸化活性の測定結果から、選択したトリペプチドは抗酸化活性が高いものから活性がないものまで段階的に異なっていることを明らかにした。これらトリペプチドについて量子化学計算を行い、トリペプチドの分子軌道とそのエネルギー、電荷分布をもとめた。これら電子状態情報とトリペプチドの抗酸化活性との相関性を調べた結果、トリペプチドにおいて電子が占有している分子軌道のうち最もエネルギーが高い軌道である最高被占軌道（HOMO）が抗酸化活性との間に相関性があることを見いだした。また、イオン化ポテンシャルとの間にも相関性があることを見いだした。さらに、トリペプチド末端のかさ高さが抗酸化活性に影響を及ぼす可能性が示唆された。これら電子状態情報および分子構造特性が、トリペプチドの抗酸化活性ならびに疾患予防効果の予測指標として利用できる可能性が高い。

In this study, we investigated the electron transfer pathway from the electron donor in bacteral membrane to the catalytic site of copper-containing methane monooxygenase. We extablished the method for removing a copper ion selectively from the mono-copper site of the copper-containing methane monooxygenase. The copper-deficient methane monooxygenase showed the activity for methane hydroxylation only when duroquinol, which can donate electrons directly to the catalytic site (di-copper site) of the copper-containing methane monooxygenase, was used as the electron donor. This result indicates that mono-copper site plays a role in the elctron mediation from the electron donor in bacterial membtarne to the catalytic site of copper-containing methane monooxygenase.

石油代替炭素資源である天然ガス主成分のメタンからメタノールを合成するプロセスは、メタノールが燃料あるいは種々の化学製品の原料となるため、特に重要である。本課題では、メタンをメタノールに直接変換する触媒として利用できる生体触媒、膜結合型メタン水酸化酵素(pMMO)を大量に調製することをめざす。特に本課題では、pMMOのうちメタン-メタノール転化反応にかかわる活性部位領域を含むドメインのみを大量調製する方法を確立する。

The mechanism for the stabilization of copper-containing methane monooxygenase (pMMO) by the formation of protein complex with methanol dehydrogenase (MDH) was elucidated. MDH protects the copper center of pMMO, which accepts electrons from the electron donor for pMMO, from hydrogen peroxide inhibiting pMMO, due to the binding of MDH to pMMO.

本研究課題では、(1)膜結合型メタン水酸化酵素(pMMO)と複合体を形成し、pMMOを安定化するタンパク質pMMO-Rの構造と機能を特定し、(2)pMMO-RによるpMMO活性安定化機構を明らかとすることをめざしている。 平成19年度は、上記(1)を達成するため以下3つの実験を行った。(1)pMMO-Rの単離精製(2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定(3)アミノ酸配列から推測されるタンパク質活性の測定。 (1)pMMO-Rの単離精製:メタン酸化細菌を培養し、得られた菌体から各種カラムクロマトグラフィーを用いてpMMO-Rの単離精製を行った。ゲル濾過カラムおよび陰イオン交換カラムによる精製の諸条件を検討し、pMMO-Rを高純度に精製することに成功した。 (2)質量分析法によるアミノ酸配列の決定:pMMO-Rのアミノ酸配列は、メタン酸化細菌由来のメタノール脱水素酵素(MDH)と同じであった。 (3)タンパク質活性の測定:pMMO-RのMDH活性を確認するため、紫外可視吸光光度計を用いてメタノール酸化活性を測定した。その結果、pMMO-Rはメタノール酸化活性を示すことがわかった。 以上の結果から、pMMO-Rは既知タンパク質であり、メタノール酸化活性を示すMDHであることがわかった。これまでに報告されているMDHの構造・機能に関する知見を加味して、MDHがpMMOと複合体を形成することで、如何にしてpMMO活性を安定化しているのかを明らかとすることが今後の課題である。

未来型資源といわれるメタンやメタノールなどのC1化合物を単一炭素源として生育可能なC1微生物を研究対象とし、高濃度メタノール生育能付与や転写スイッチの利用といった代謝改変と制御により、C1化合物を原料にしたものづくりの基盤を構築することを目的としている。 2023年度は、2022年度までに取得していたMethylorubrum extorquensの高濃度メタノール耐性実験室進化株の全ゲノムリシーケンスの結果から責任遺伝子を予想し、解析を進めた。実験室進化株に見出された変異を実験室進化の親株に導入し、高濃度メタノール添加条件下で培養した。その結果、親株と比較して良好な生育能を示したが、その生育速度は実験室進化株より顕著に遅く、高濃度メタノール耐性への寄与は部分的であることが示された。得られた実験室進化株について、高濃度メタノール添加条件で培養し、物質生産のターゲットとしている微生物産生生分解性プラスチック、ポリヒドロキシアルカン酸（PHA）の蓄積量を測定したところ、親株と比較して2倍程度増加していた。 また、2022年度までに構築したM. extorquens代謝改変株を宿主として、PHAモノマー前駆体を供給する酵素遺伝子発現のタイミングを転写スイッチを用いて検討した。培養開始時に当該遺伝子の発現を誘導したところ、生育が著しく阻害された。一方で、生育後に誘導した際には、PHAの第二、第三モノマー分率が非誘導の株と比較して5倍程度増加していた。今後、実験室進化株内で同様に転写スイッチによるPHAモノマー分率の制御を行う予定である。

メタン変換バイオ触媒はメタン-メタノール変換プロセスを大幅に省エネルギー化し、CO2 排出量を抑制できる。本研究ではメタン変換バイオ触媒の性能に有機無機ハイブリッドコーティングが及ぼす影響を明らかにし、このコーティング法を応用したメタン変換バイオ触媒が社会実装可能な性能を示すかどうかを検証する。本手法の有効性を実証することで、常温常圧，一段階での省エネ型メタン変換プロセスの実現に向けた研究展開をめざす。 2023年度は、高分子電解質としてポリ（ジアリルジメチルアンモニウムクロリド）（PDADMAC）、金属酸化物として酸化ケイ素（SiO2）を用いたメタン変換バイオ触媒表面へのコーティング手法を検討した。メタン酸化バイオ触媒であるバクテリア細胞を培養し、このバクテリア細胞へ種々の条件（PDADMAC や TMOS 濃度、処理時間、温度）でPDADMACとSiO2を順に吸着させることで、コーティング状態の異なるバイオ触媒を調製した。得られた種々メタン変換バイオ触媒について、メタンからメタノールへの転化反応に対する触媒活性と寿命を評価した。その結果、SiO2はメタン酸化バクテリアのメタノール生産性能に影響を及ぼさないのに対して、PDADMCはその性能を低下させる効果を示した。そこでさらに、PDADMAC濃度や吸着溶液のpH、ならびに処理時間や分離方法を検討した。その結果、メタノール生産性能をほぼ維持した状態でメタン酸化バクテリア細胞表面をPDADMACおよびSiO2でコーティングできる条件を見出すことに成功した。

We aimed to create an enzyme that produces primary alcohols from n-alkanes by substituting amino acid residues near the catalytic site of the enzyme cytochrome P450BM-3. Various enzymes introducing bulky functional groups and controlling the space size near the catalytic site of cytochrome BM-3 were synthesized and their activity for n-alkane oxidation was investigated. The selectivity for primary alcohols in the oxidation reactions depends on the molecular size of the amino acid residues introducing near the catalytic site. According to the dependency, we synthesized the enzyme introducing two tryptophan residues near the catalytic site of cytochrome BM-3. The enzyme showed primary alcohol selectivity up to 51% in n-alkane oxidation.