共同研究・競争的資金等の研究課題

翻訳装置リボソームは、がん細胞ではその合成過程の活性化により合成量が増え、その結果がん細胞の成長と増殖に必要なタンパク質量を供給できる。近年では、そのリボソーム自体が構成を変化させることで、疾患特異的な翻訳を行なう特殊なリボソームの存在が考えられている。本研究では臨床サンプルを用いて、組織レベルでの特殊なリボソームの同定とその分子的な実体を解明することで、特殊なリボソームを標的とする疾患治療戦略に繋げる。 翻訳装置リボソームは、がん細胞ではその合成過程の活性化により合成量が増え、その結果がん細胞の成長と増殖に必要なタンパク質量を供給できる。近年では、そのリボソーム自体が構成を変化させることで、疾患特異的な翻訳を行なう特殊なリボソームの存在が考えられている。本研究では、必要なサンプル量と分析感度の問題からいまだ手つかずのままである臨床検体を用いた特殊化リボソーム解析を、研究代表者が開発した効率的かつ高感度なリボソーム分離法Ribo Mega-SECを用いて解析する。そして海外共同研究者が確立している最新のプロテオーム解析技術を融合させることで、がん組織中の特殊化リボソーム解析法を確立し、特殊化がん原リボソームの分子的実体と細胞内機能、細胞がん化との関連を解明することを目的としている。最終的な目標は、特殊なリボソームを標的とする疾患治療戦略に繋げることである。 今年度は外国機関に渡航し、本研究の遂行に重要なMega-SECの立ち上げを行った。渡航先では現所属の分析装置とは異なる装置を用いたが、現所属で得られている分離パターンと同様の結果を得ることができたため、本手法の再現性の高さを確認することができた。また渡航先では当初の計画にはなかった最新鋭の質量分析計を導入したため、その使用方法についてのトレーニングを開始した。最新鋭の質量分析計は高深度でのプロテオーム解析が非常に高いスループットで行うことができる。すなわち本方法の習得により、ごく微量の臨床検体からも高感度にリボソーム構成因子の解析が可能になるものと考えている。 臨床検体からのリボソーム構成因子の解析までは至っていないものの、臨床検体から得られる実サンプル量を考慮すると、上述の最新鋭の質量分析計による超高感度プロテオーム解析法の習得は本研究にとって非常に有益なものと考えられる。そのため当初の計画からはやや遅れているものの、研究プロジェクト全体を通して見ると着実に進んでいると言える。 次年度は渡航先ですでに立ち上げを完了しているMega-SEC法を用いて、臨床検体由来のリボソームを抽出し、最新鋭の質量分析計による超高感度プロテオーム解析法によって、がん特異的なリボソーム構成因子の同定を行う。これにより、がん組織特異的な特殊化リボソーム解析法を確立する。さらに、立体構造の観点からもリボソーム特異性の解析を行い、がん組織特異的な特殊化リボソームの分子的実態の解明を目指す。

HPV陽性扁平上皮癌は子宮頸部では90% 以上、頭頸部癌では10% 程度を占める重要な扁平上皮癌の亜型である。近年、子宮頸癌ワクチンとしてHPV ワクチンが開発されたことで、欧米では発症率が大幅に減少したものの、本邦では副反応が問題になったことで、接種率が低いこと、また男性は接種しないことから依然として発生率の高い癌の一つである。そのため、特異的な分子標的治療法の開発は臨床上の重要な課題である。本研究では、申請者らが見出したHPVウイルスタンパク質であるE6、E7からなる新規タンパク質複合体の性状を最新の定量プロテオミクスを用いて解析し、HPV陽性扁平上皮癌の分子標的治療の分子基盤の確立を目指す。 HPV陽性扁平上皮癌は子宮頸部では90% 以上、頭頸部癌では10% 程度を占める重要な扁平上皮癌の亜型である。近年、子宮頸癌ワクチンとしてHPV ワクチンが開発されたことで、欧米では発症率が大幅に減少したものの、本邦では副反応が問題となり、依然として発生率の高い癌の一つである。そのため、特異的な分子標的治療法の開発は臨床上の重要な課題である。 本研究では、研究代表者らが見出したHPVウイルスタンパク質であるE6、E7からなる新規タンパク質複合体の性状を最新の定量プロテオミクスを用いて解析し、HPV陽性扁平上皮癌の分子標的治療の分子基盤の確立を目指す。これまでに脱ユビキチン化酵素MPNDはE6やE7と結合し、複合体を形成することを見出しており、この新規複合体の相互作用タンパク質の同定を試みた。しかしながら有意な結果を得ることができなかった。問題点としては①MPNDの免疫沈降に使用可能な抗体が存在しない、②過剰発現系を用いると非特異的なシグナルが上昇してしまう、ことが挙げられた。問題点を解決するため、今年度は染色体上のMPND遺伝子座に3xFlagタグを挿入し、内在性のMPNDをFlag標識することに成功した。次年度以降、このシステムを用いて内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。口腔がん臨床サンプルにおけるMPNDの関連の解析に関しては、複数の市販抗体、受託にて作成した抗体(2社)を用いて、条件検討を行ったものの、陽性所見を得ることができなかった。近年、MPNDがDNA m6A修飾を認識するドメインを有することが報告された。そこで、HPV陰性、陽性がん細胞株でm6Aを定量したところ、HPV陽性がんで上昇することを新たに見出した。次年度以降、MPNDの代わりにm6Aの抗体を用いて臨床サンプルの解析や分子機構の解析を進める。 着目する脱ユビキチン化酵素MPNDに対する複数の市販抗体がMPNDを検出することができなかったため、前年度2社でそれぞれ異なる抗原ペプチドを用いて受託にて抗体作成を行った。本年度、これらの2種類の抗体を用いて検討を行ったものの、MPNDを検出することができなかった。以上によりやや遅れていると評価した。 次年度以降は、前述の本年度樹立に成功した内在性MPNDが3xFlag標識された細胞株を用いて、内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。また、本年度新たにHPV感染とDNAのm6A修飾の関連性を明らかにしたことから、次年度以降に口腔がん臨床サンプルにおけるHPV感染とDNA m6Aの関連の解析を抗m6A抗体を用いて、進める。さらに、MPND複合体とDNA m6Aの相互作用による分子機構に関してもDNA m6Aのメチル化酵素であるN6AMT1や脱メチル化酵素ALKBH1,4に対するshRNAなどを用いて、主に培養細胞株で検討する。また、これまでの研究結果より、MPNDはE6及びE7非存在下では細胞質に局在し、E6及びE7存在下では核内にも集積することを見出しており、前述の内在性にMPNDがFlag 標識された細胞株を用いて、細胞内局在変化に関しても詳細な検討を加える。

クロスリンク質量分析法は、細胞内での網羅的なタンパク質間相互作用解析および構造既知の複合体形成タンパク質間のトポロジー解析に不可欠な技術である。ここでは特定残基間を架橋する試薬（クロスリンカー）が必須であるが、既存試薬はリジン（Lys）側鎖アミノ基架橋型のみである。これは高いLys選択性を長所とする一方、残基架橋情報がLys-Lys間に限定される。さらに、活性エステルを利用するため、安定性の観点から細胞内適応は制限される。そこで本研究では、Lys以外を対象とする、安定かつオンデマンドな活性化が可能なクロスリンカーを開発し、当該リンカーによるタンパク質間トポロジー解析への展開可能性を検証する。

生物は、外界の変化を受容体により感知し、適切なシグナル出力を行うことで柔軟に対処している。シグナルの出力には、それを支える代謝リソース（糖、アミノ酸、イオンなど）が細胞内に十分量存在することが重要である。しかし、細胞内の代謝リソースの存在を分子シグナルへ変換する機構や、それを外界刺激応答へ伝達・入力する機構は解析例が乏しく不明な点が多い。本研究では、代謝リソースとして「糖」、外部刺激応答として「植物免疫」を題材として取り上げ、糖が分子シグナルに変換され植物免疫シグナルの出力を調整する機構の分子メカニズムの解明に挑み、細胞内環境とシグナル強度との関連性について理解を深める。

リボソームは生物に必須の細胞内翻訳装置である。がん細胞はリボソーム合成を活性化させてリボソーム量を増やし、その成長と増殖に必要なタンパク質量を確保する。転写因子Mycはリボソームの全構成成分の遺伝子転写と、リボソーム自体の合成に必要なタンパク質群の遺伝子転写を促進することで、リボソーム量の増加に寄与する。本研究では、Mycによるリボソームの質的変化とそれに起因する翻訳能の変化も細胞がん化に関わるのではないか？という仮説のもと、Myc依存的なリボソームとの相互作用タンパク質の変化を系統的に解析することを目的としている。 本年度はまず、本研究の中核をなす「Ribo Mega-SEC：サイズ排除クロマトグラフィーによるリボソームの分離法」を、現所属でも確立した。この際に、現所属で新たに導入したuHPLC装置に適した形でリボソームの分離条件を最適化した結果、従来法よりも高感度で、かつ高再現的にリボソームを分離することができた。重要なことに、現在の方法では高感度がゆえに数十マイクログラム程度のタンパク質を含む試料からもリボソームを分離でき、さらに試料間でポリソーム量・リボソームサブユニット量の統計的有意な変動も見出している。このことは、将来的に臨床検体などのタンパク質量に限りのある試料からのリボソームの分離と解析も可能であることを示している。 この最適化したRibo Mega-SECを用いて、当初の計画通りリボソームインタラクトーム解析法を立ち上げた。具体的には、Myc発現時・非発現時の細胞抽出液をポリソームと各リボソームサブユニットに分離・分画し、質量分析計を用いたラベルフリー定量プロテオーム法により解析し、ポリソームおよび各リボソームサブユニットに特異的に相互作用するタンパク質を同定した。

ガン細胞が無制限かつ迅速に増殖できるのは、細胞が必要とするエネルギーと物質の6～8割も使うリボソーム生合成を効率化しているからである。ガン細胞でだけリボソーム生合成を効率化する因子を見つけ、その働きを抑えられれば、ガン細胞の増殖だけを抑えられるはずである。本研究は、LYARがそのような因子であるとの知見を基に、LYARの働きを阻害する化合物のスクリーニング法の開発を試みた。LYARがリボソーム生合成を促進する分子機構を解析した結果、当初想定していたBRD4ではなく、別のタンパク質への直接結合が必要であることが明らかになった。その結果を基に新たなガン治療薬のスクリーニング系の構築が可能になった。

ポストリソソーム生物学研究を推進するため、slackを使った関連情報の共有や３ヶ月に一回のwebベースのミーテイングでの進捗報告を通してメンバー間で緊密な連携をとる体制を構築した。また、アドバイザーの先生を交えたキックオフミーティングを開催し、研究の方向性に関する助言を得た。領域の概要や活動報告についてHPを作製(https://post-lysosome.jp/)して情報発信を開始した。

細胞内の分解の場であるリソソームが生存・寿命を制御するシグナルを発信するという新しいコンセプトが生まれつつある。しかしながら、どの臓器からどのようなポストリソソームシグナルが発信されているのか、その実体は明らかにされていない。本研究では、ポストリソソームシグナルの起点となる臓器を同定すると共に、開放血管系を持つショウジョウバエの利点を生かした体液の比較マルチオミクス解析により、寿命延長につながる体液中のポストリソソームメディエーターの網羅的な同定を目指している。 体液中のポストリソソームメディエーターを同定するため、野生型、オートファジー不全系統、またリソソーム機能が低下した変異体より体液を回収し、体液の比較プロテオミクスを実施し、オートファジー・リソソーム機能の低下により存在量が有意に変動する一群のタンパク質を同定した。また、寿命延長につながるポストリソソームシグナルの起点となる臓器を探索するためのツールを整備した。