Research projects

翻訳装置リボソームは、がん細胞ではその合成過程の活性化により合成量が増え、その結果がん細胞の成長と増殖に必要なタンパク質量を供給できる。近年では、そのリボソーム自体が構成を変化させることで、疾患特異的な翻訳を行なう特殊なリボソームの存在が考えられている。本研究では臨床サンプルを用いて、組織レベルでの特殊なリボソームの同定とその分子的な実体を解明することで、特殊なリボソームを標的とする疾患治療戦略に繋げる。 翻訳装置リボソームは、がん細胞ではその合成過程の活性化により合成量が増え、その結果がん細胞の成長と増殖に必要なタンパク質量を供給できる。近年では、そのリボソーム自体が構成を変化させることで、疾患特異的な翻訳を行なう特殊なリボソームの存在が考えられている。本研究では、必要なサンプル量と分析感度の問題からいまだ手つかずのままである臨床検体を用いた特殊化リボソーム解析を、研究代表者が開発した効率的かつ高感度なリボソーム分離法Ribo Mega-SECを用いて解析する。そして海外共同研究者が確立している最新のプロテオーム解析技術を融合させることで、がん組織中の特殊化リボソーム解析法を確立し、特殊化がん原リボソームの分子的実体と細胞内機能、細胞がん化との関連を解明することを目的としている。最終的な目標は、特殊なリボソームを標的とする疾患治療戦略に繋げることである。 今年度は外国機関に渡航し、本研究の遂行に重要なMega-SECの立ち上げを行った。渡航先では現所属の分析装置とは異なる装置を用いたが、現所属で得られている分離パターンと同様の結果を得ることができたため、本手法の再現性の高さを確認することができた。また渡航先では当初の計画にはなかった最新鋭の質量分析計を導入したため、その使用方法についてのトレーニングを開始した。最新鋭の質量分析計は高深度でのプロテオーム解析が非常に高いスループットで行うことができる。すなわち本方法の習得により、ごく微量の臨床検体からも高感度にリボソーム構成因子の解析が可能になるものと考えている。 臨床検体からのリボソーム構成因子の解析までは至っていないものの、臨床検体から得られる実サンプル量を考慮すると、上述の最新鋭の質量分析計による超高感度プロテオーム解析法の習得は本研究にとって非常に有益なものと考えられる。そのため当初の計画からはやや遅れているものの、研究プロジェクト全体を通して見ると着実に進んでいると言える。 次年度は渡航先ですでに立ち上げを完了しているMega-SEC法を用いて、臨床検体由来のリボソームを抽出し、最新鋭の質量分析計による超高感度プロテオーム解析法によって、がん特異的なリボソーム構成因子の同定を行う。これにより、がん組織特異的な特殊化リボソーム解析法を確立する。さらに、立体構造の観点からもリボソーム特異性の解析を行い、がん組織特異的な特殊化リボソームの分子的実態の解明を目指す。

HPV陽性扁平上皮癌は子宮頸部では90% 以上、頭頸部癌では10% 程度を占める重要な扁平上皮癌の亜型である。近年、子宮頸癌ワクチンとしてHPV ワクチンが開発されたことで、欧米では発症率が大幅に減少したものの、本邦では副反応が問題になったことで、接種率が低いこと、また男性は接種しないことから依然として発生率の高い癌の一つである。そのため、特異的な分子標的治療法の開発は臨床上の重要な課題である。本研究では、申請者らが見出したHPVウイルスタンパク質であるE6、E7からなる新規タンパク質複合体の性状を最新の定量プロテオミクスを用いて解析し、HPV陽性扁平上皮癌の分子標的治療の分子基盤の確立を目指す。 HPV陽性扁平上皮癌は子宮頸部では90% 以上、頭頸部癌では10% 程度を占める重要な扁平上皮癌の亜型である。近年、子宮頸癌ワクチンとしてHPV ワクチンが開発されたことで、欧米では発症率が大幅に減少したものの、本邦では副反応が問題となり、依然として発生率の高い癌の一つである。そのため、特異的な分子標的治療法の開発は臨床上の重要な課題である。 本研究では、研究代表者らが見出したHPVウイルスタンパク質であるE6、E7からなる新規タンパク質複合体の性状を最新の定量プロテオミクスを用いて解析し、HPV陽性扁平上皮癌の分子標的治療の分子基盤の確立を目指す。これまでに脱ユビキチン化酵素MPNDはE6やE7と結合し、複合体を形成することを見出しており、この新規複合体の相互作用タンパク質の同定を試みた。しかしながら有意な結果を得ることができなかった。問題点としては①MPNDの免疫沈降に使用可能な抗体が存在しない、②過剰発現系を用いると非特異的なシグナルが上昇してしまう、ことが挙げられた。問題点を解決するため、今年度は染色体上のMPND遺伝子座に3xFlagタグを挿入し、内在性のMPNDをFlag標識することに成功した。次年度以降、このシステムを用いて内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。口腔がん臨床サンプルにおけるMPNDの関連の解析に関しては、複数の市販抗体、受託にて作成した抗体(2社)を用いて、条件検討を行ったものの、陽性所見を得ることができなかった。近年、MPNDがDNA m6A修飾を認識するドメインを有することが報告された。そこで、HPV陰性、陽性がん細胞株でm6Aを定量したところ、HPV陽性がんで上昇することを新たに見出した。次年度以降、MPNDの代わりにm6Aの抗体を用いて臨床サンプルの解析や分子機構の解析を進める。 着目する脱ユビキチン化酵素MPNDに対する複数の市販抗体がMPNDを検出することができなかったため、前年度2社でそれぞれ異なる抗原ペプチドを用いて受託にて抗体作成を行った。本年度、これらの2種類の抗体を用いて検討を行ったものの、MPNDを検出することができなかった。以上によりやや遅れていると評価した。 次年度以降は、前述の本年度樹立に成功した内在性MPNDが3xFlag標識された細胞株を用いて、内在性のMPND複合体を精製し、質量分析することで相互作用タンパク質の同定に取り組む。また、本年度新たにHPV感染とDNAのm6A修飾の関連性を明らかにしたことから、次年度以降に口腔がん臨床サンプルにおけるHPV感染とDNA m6Aの関連の解析を抗m6A抗体を用いて、進める。さらに、MPND複合体とDNA m6Aの相互作用による分子機構に関してもDNA m6Aのメチル化酵素であるN6AMT1や脱メチル化酵素ALKBH1,4に対するshRNAなどを用いて、主に培養細胞株で検討する。また、これまでの研究結果より、MPNDはE6及びE7非存在下では細胞質に局在し、E6及びE7存在下では核内にも集積することを見出しており、前述の内在性にMPNDがFlag 標識された細胞株を用いて、細胞内局在変化に関しても詳細な検討を加える。

クロスリンク質量分析法は、細胞内での網羅的なタンパク質間相互作用解析および構造既知の複合体形成タンパク質間のトポロジー解析に不可欠な技術である。ここでは特定残基間を架橋する試薬（クロスリンカー）が必須であるが、既存試薬はリジン（Lys）側鎖アミノ基架橋型のみである。これは高いLys選択性を長所とする一方、残基架橋情報がLys-Lys間に限定される。さらに、活性エステルを利用するため、安定性の観点から細胞内適応は制限される。そこで本研究では、Lys以外を対象とする、安定かつオンデマンドな活性化が可能なクロスリンカーを開発し、当該リンカーによるタンパク質間トポロジー解析への展開可能性を検証する。

生物は、外界の変化を受容体により感知し、適切なシグナル出力を行うことで柔軟に対処している。シグナルの出力には、それを支える代謝リソース（糖、アミノ酸、イオンなど）が細胞内に十分量存在することが重要である。しかし、細胞内の代謝リソースの存在を分子シグナルへ変換する機構や、それを外界刺激応答へ伝達・入力する機構は解析例が乏しく不明な点が多い。本研究では、代謝リソースとして「糖」、外部刺激応答として「植物免疫」を題材として取り上げ、糖が分子シグナルに変換され植物免疫シグナルの出力を調整する機構の分子メカニズムの解明に挑み、細胞内環境とシグナル強度との関連性について理解を深める。

The ribosome is an intracellular machinery to translate mRNAs to proteins. In cancer cells, ribosome biogenesis which occurs in nucleoli is highly activated to increase in the ribosomes, leading to elevated protein synthesis enabling cell growth and proliferation. Myc, a transcription factor, increases in the ribosomes by upregulating transcription of ribosomal protein genes and ribosomal RNA. In this study, we hypothesized that Myc can alter ribosome biogenesis and generate Myc-dependent specialised ribosomes, resulting in changes in mRNA translation leading to tumorigenesis. Therefore, I aimed to identify changes in protein composition in the ribosomes between normal cells and high Myc-expressing cells.

The cancer cells can grow indefinitely and quickly by increasing the efficiency of ribosome biogenesis that use the 60-80% of the energy and substances for which the cells are required. By inhibiting the action of a factor that increases the efficiency of the ribosome biogenesis in cancer cells, it is expected to suppress the proliferation of cancer cells. This study, based on the finding that LYAR is a such factor, has attempted to develop methods of screening for compounds that inhibit the action of LYAR. By analyzing the molecular mechanisms by which LYAR promote ribosome biogenesis, we identified a new factor that bind to LYAR without any co-factor between them. Unexpectedly, BRD4 was not the one that bind to directly to LYAR. It has become possible to develop a screening system of a new cancer treatment drugs based on the results.

In order to promote research on post-lysosome biology, the members of the project team worked in close collaboration with each other through the sharing of relevant information using slack and progress reports in web-based or face-to-face meetings once every three months. In addition, a total of three area meetings were held with advisors to obtain suggestions on the direction of research. Three jointly co-sponsored symposia were held at academic conferences to promote the activities of the field. Obtained results were published as peer-reviewed papers. Information on these activities was disseminated on the website (https://post-lysosome.jp/).

It is proposed that lysosomes transmit signals that control animal survival and lifespan; however, their nature and mechanisms are poorly understood. In this study, we comprehensively analyzed the effect of the loss-of-function of the autophagy-lysosome system on the proteome and metabolome in the body fluid by comparative multi-omics analysis, providing the fundamental data sets for the study of post-lysosome signals.