共同研究・競争的資金等の研究課題

近年、研究代表者らは一部の抗体医薬品が生体内において、糖鎖の変化、アミノ酸の脱アミド化、末端アミノ酸切断など生体内での構造変化（バイオトランスフォーメーション）を発見している。本研究では、抗体医薬品のバイオトランスフォーメーションの実態を解明し臨床的意義を明らかにすることを目的とする。関節リウマチ患者を対象としたKURAMAコホートを用い、研究代表者らにより確立された独自の測定技術を活用する。さらに、バイオトランスフォーメーションの臨床効果への影響について疫学専門家による臨床情報の解析も実施する。本研究により抗体医薬品の真の体内動態が明らかになり臨床効果の説明が可能となることが期待される。

バイオ医薬品はヒトの体内で免疫原性を持つことから、抗体医薬品に対する抗体（抗薬物抗体）が出現し、極端な薬効低下が引き起こす。しかし、抗薬物抗体の実態や出現要因に関する情報は不足する。それは、適切な臨床サンプルと測定技術に基づく研究成果が無いことにも起因する。本研究では、京大病院のリウマチ患者を対象としたKURAMAコホートを用い、革新的な測定技術を活用して、抗薬物抗体の実態解明を目指す。さらに、抗薬物抗体出現要因や臨床効果への影響について、疫学専門家による臨床情報の解析も実施する。本研究成果は、抗体医薬品使用における免疫原性の回避法の確立や個別化医療の実現に有益な、基礎的情報を提供する。 2021年度は、京都大学医学部附属病院リウマチセンターKURAMAコホートとして登録されている311例のインフリキシマブが投与された関節リウマチ患者のうち、データが揃う41例について、バイオマーカーの解析を実施した。インフリキシマブは質量分析系で、抗薬物抗体とサイトカインはMeso Scale Discovery社の QuickPlex SQ120を用いて測定した。抗薬物抗体9例において血中濃度低下と判定され、DAS28-ESRで判定した臨床効果の減弱が確認された。他方、4例で抗薬物抗体の陽性が検出されたが、臨床効果との相関は認められなかった。さらに、前向きの治療効果継続の予測についても、IL6と組み合わせて血中濃度測定の有用性が示唆された。 また、質量分析を用いた解析の結果、エタネルセプトで体内での、N末端2アミノ酸切断（バイオトランスフォーメーション）が明らかとなった。詳細な解析の結果、DPP4の関与が明らかとなった。効果との相関や他の抗体医薬品におけるバイオトランスフォーメーションならびに抗薬物抗体の反応性を今後検討予定である。抗体医薬品が生体内で構造変化を受けることは、ほとんど報告のない新しい現象で、バイオ医薬品の体内動態研究に新しい概念を提唱するものと考える。 抗薬物モノクローナル抗体の作製が遅れているが、臨床効果との相関解析やバイオトランスフォーメーションの発見は想定より進んでいる。 昨年度までに収集したデータの解析を進め、バイオマーカーの同定とバイオトランスフォーメーションの実態解明を進める計画である。

腎臓は様々な小器官から成る臓器である。そこで、シスプラチン腎症起点部位である尿細管を単離してマイクロアレイ解析を行い、腎毒性発現に関与する遺伝子の探索を行った。まず、本手法の妥当性を検証し、尿細管の遺伝子発現を反映することを確認した。さらに、病態モデルラットの単離尿細管を用いて解析を行ったところ、ケモカイン類の顕著な発現上昇が認められた。以上より、ケモカイン類が尿細管におけるシスプラチン腎毒性発現の規定因子となることが示唆された。

メタボリックシンドローム患者では、生体因子の変化によって、薬物の感受性が変わることが推定される。本研究によって、様々な疾患において薬物トランスポータの発現が変動し、薬の体内での動きが変化することを明らかにした。特に、薬物排出トランスポータMATE1の発現・機能変動が、糖尿病治療薬メトホルミンや抗がん剤シスプラチンの薬効・副作用発現に影響を与えることを示した。これらの研究成果は、メタボリックシンドローム患者における薬物療法の適正化に繋がると考えられる。

昨年度までに、有機カチオントランスポータOCT2の阻害によって、シスプラチンの腎毒性を軽減できることを明らかにした。本年度は、さらに排出型トランスポータMATE1の影響を検討した。Mate1ノックアウトマウスにシスプラチンを投与すると、野生型に比べて強い腎毒性が観察された。さらに、シスプラチンの腎蓄積の上昇も観察された。また、Mate1阻害薬ピリメタミンの同時投与によっても腎毒性は増強された。したがって、遺伝子多型や薬物間相互作用によるMATE1の阻害抑制は、シスプラチンを用いた化学療法時に腎毒性の危険性を増大させることが示唆された。 また、OCT2阻害薬共存による抗腫瘍効果への影響を検討した。様々な肺がん由来細胞においてOCT2の発現はほとんど観察されず、OCT2阻害薬シメチジン共存による細胞毒性への影響は認められなかった。また、ヒトがん由来cDNAパネルを用いて、各種腫瘍組織におけるOCT2発現変化を検討したが、ほとんどの細胞でOCT2の発現は認められなかった。したがって、OCT2の阻害薬はシスプラチンの抗腫瘍効果への影響はほとんどないことが明らかとなった。 以上より、シスプラチンの腎毒性発現には、血管側に発現する有機カチオントランスポータOCT2が関与することが示された。一方、排出トランスポータMATE1はシスプラチン腎症の保護因子となり、薬物間相互作用等におけるMATE1の機能阻害は、腎毒性の危険因子の一因となることが示唆された。

リボフラビントランスポータRFTが同定された。本研究では、RFT1およびそのホモログの生理的役割の解明を目指すことを目的に検討を行った。その結果、脳などに発現する新規トランスポータRFT3を同定し、各トランスポータの機能特性を明らかにした。さらに、リボフラビン感受性の新生児MADD患者においてRFT1遺伝子の一部欠損を有することを報告した。また、RFTがHGNCデータベースに登録された。以上より、RFT生理的役割について新しい知見が得られた。

腎臓の近位尿細管に局在する薬物の運び屋タンパク質（トランスポータ）の役割について明らかにすることを目的として、トランスポータを発現していないマウスを用いた解析を行った。その結果、腎臓のトランスポータによって運ばれることがわかっている薬物であっても、その尿中排泄における寄与は異なっていることが明らかになった。またトランスポータ機能低下によって薬物の血中濃度や組織中濃度が変動し、薬物の副作用を引き起こすことを明らかにした。

リボフラビントランスポータRFVT遺伝子欠損における病態生理の解明を目指して、in vivoやin vitro実験系を用いた解析を行った。その結果、マウスおよび培養細胞を用いた検討から、RFVT2は小腸下部に高発現し腸上皮細胞内への取り込みを媒介することを明示した。さらに、海外研究者との共同研究により、既報のRFVT3変異に加えて、RFVT2の機能低下がBrown-Vialetto-Van Laere syndrome (BVVLS)発症の原因になる可能性を示した。これらの成果は、BVVLSの病態生理に関する基礎的情報を得られ、治療法開発に大きく貢献したと考える。

パーキンソン病（PD）の治療ではLドパは大変有効であるが、長期投与に伴うウエアリング・オフは最も改善すべき問題である。本研究ではLドパ長期投与に伴う薬物動態の変化と遺伝的要因を明らかにする目的で以下の検討を行った。 PD患者に、Lドパ単独あるいはLドパとエンタカポン（Lドパ代謝酵素COMTの阻害薬）を併用した場合のLドパ血中濃度と、COMT遺伝子多型が及ぼす影響について検討した。Lドパの血中濃度下面積はCOMTの活性が低い遺伝子多型の場合、エンタカポン投与でも変化しないことが示唆された。よってエンタカポンがLドパの血中濃度に及ぼす影響は、COMT遺伝子多型により変動を受けることが考えられた。

リボフラビン(ビタミンB2)は橙黄色の水溶性ビタミンであり、糖、脂質、アミノ酸の代謝などで重要な役割を果たす。リボフラビントランスポータRFVT 遺伝子欠損における病態生理の解明を目的とし研究を行なった。その結果、マウスにおいてRFVTの欠損により、エネルギー源の代謝異常が確認され、これはリボフラビンの欠乏に起因することが明示された。本研究成果は、RFVT遺伝子欠損の関わる希少疾患の治療法開発に繋がると期待される。

研究計画初年度である平成19年度では、単離尿細管という極微量試料を用いた網羅的遺伝子発現解析の手法を確立した。また、シスプラチン投与による尿細管障害モデルおよびGFR低下モデルを作成した。平成20年度には腎障害モデルラットにおける単離尿細管遺伝子発現プロファイルの構築と尿細管由来の腎障害メディエイターの探索へと進展できると考える。 (1)単離尿細管を用いた遺伝子発現プロファイルの構築と評価 ラット腎臓より近位尿細管20mmを単離し、DIGラベルcRNAを7-10ug作成した。DNAアレイ解析にはGenome Survey MicroarrayRを用い、尿細管遺伝子発現プロファイルを構築した。シグナル/ノイズ比3.0以上を基準として全27,000遺伝子のうち約10,000遺伝子が検出され、本実験系により単離尿細管の網羅的遺伝子発現解析が可能であることが示された。さらに、近位尿細管上皮細胞に発現することが報告されているSlc22a1,5,8のシグナルは単離尿細管を用いることでwhole kidneyと比べ有意に強く、単離尿細管遺伝子発現解析の有用性が明らかになった。 (2)腎機能障害モデルラットの作成 シスプラチンの腎特異的な毒性発現機構として、近位尿細管特異的に発現する有機カチオントランスポータOCT2が規定因子となることを明らかにした。さらに、2mg/kgのシスプラチン投与によりKim-1の発現および尿中NAG活性の上昇をきたす尿細管障害モデルを、10mg/kgのシスプラチン投与によりGFR低下をきたす腎機能障害モデルを作成できることを示した。