Research projects

近年、研究代表者らは一部の抗体医薬品が生体内において、糖鎖の変化、アミノ酸の脱アミド化、末端アミノ酸切断など生体内での構造変化（バイオトランスフォーメーション）を発見している。本研究では、抗体医薬品のバイオトランスフォーメーションの実態を解明し臨床的意義を明らかにすることを目的とする。関節リウマチ患者を対象としたKURAMAコホートを用い、研究代表者らにより確立された独自の測定技術を活用する。さらに、バイオトランスフォーメーションの臨床効果への影響について疫学専門家による臨床情報の解析も実施する。本研究により抗体医薬品の真の体内動態が明らかになり臨床効果の説明が可能となることが期待される。

Unlike conventional low-molecular-weight drugs, therapeutic antibody has immunogenicity, and anti-drug antibodies are produced in the body. In this study, we clarified the characteristics of anti-drug antibodies against various therapeutic antibodies, investigated the effects on clinical efficacy and on the pharmacokinetics of therapeutic antibodies in patients with autoimmune diseases. Although the production of anti-drug antibodies is observed in many therapeutic antibodies, their characteristics varied, such as reducing the blood concentration of therapeutic antibody, some not, and others depending on the measurement method. The clinical effect has stronger correlation with the blood concentration of therapeutic antibody. In addition, biotransformation of therapeutic antibodies was also discovered.

Kidney consists of several renal segments. To clarify the gene expression profile in the renal tubule, which is the origin of cisplatin-induced nephrotoxicity, microarray analysis using the isolated tubules was carried out. At first, we confirmed that this experimental method reflected the tubular gene expression. In the isolated tubules of cisplatin-treated rats, the gene expression of chemokines was elevated. Chemokines are suggested to be the key factors of the renal tubular genes in cisplatin-induced nephrotoxicity.

Drug response is likely altered in the patient with metabolic syndrome. The present results indicated that the expression levels of drug transporters were varied, and pharmacokinetics was changed in several diseases. Especially, we clearly revealed that an efflux transporter MATE1 could influence the sensitivities of anti-diabetic drug metformin and anti-cancer drug cisplatin. These outcomes can lead to the optimized pharmacotherapy in metabolic syndrome patients.

昨年度までに、有機カチオントランスポータOCT2の阻害によって、シスプラチンの腎毒性を軽減できることを明らかにした。本年度は、さらに排出型トランスポータMATE1の影響を検討した。Mate1ノックアウトマウスにシスプラチンを投与すると、野生型に比べて強い腎毒性が観察された。さらに、シスプラチンの腎蓄積の上昇も観察された。また、Mate1阻害薬ピリメタミンの同時投与によっても腎毒性は増強された。したがって、遺伝子多型や薬物間相互作用によるMATE1の阻害抑制は、シスプラチンを用いた化学療法時に腎毒性の危険性を増大させることが示唆された。 また、OCT2阻害薬共存による抗腫瘍効果への影響を検討した。様々な肺がん由来細胞においてOCT2の発現はほとんど観察されず、OCT2阻害薬シメチジン共存による細胞毒性への影響は認められなかった。また、ヒトがん由来cDNAパネルを用いて、各種腫瘍組織におけるOCT2発現変化を検討したが、ほとんどの細胞でOCT2の発現は認められなかった。したがって、OCT2の阻害薬はシスプラチンの抗腫瘍効果への影響はほとんどないことが明らかとなった。 以上より、シスプラチンの腎毒性発現には、血管側に発現する有機カチオントランスポータOCT2が関与することが示された。一方、排出トランスポータMATE1はシスプラチン腎症の保護因子となり、薬物間相互作用等におけるMATE1の機能阻害は、腎毒性の危険因子の一因となることが示唆された。

Riboflavin transporters had been identified. The purpose of this study is to clarify the physiological role of RFT1 and its homologues. RFT3, which is expressed in the brain, was identified. The functional characteristics of RFTs were elucidated. Heterozygous deletion in the RFT1 gene was found. In addition, RFT genes were registered in the HGNC database. In conclusion, we obtained novel findings in the physiological role of RFTs.

To elucidate the physiological and pharmacokinetic significance of the renal drug transporters, we carried out the pharmacokinetic and toxicokinetic analyses of various drugs using transporter-deficient mice. It was demonstrated that the contribution of renal drug transporters to urinary excretion vary among substrate drugs. In addition, it was found that loss of transporter function lead to the changes in blood and tissue concentration of drugs, which in turn causes the adverse reaction of drugs.

In the present study, we carried out in vitro, in vivo and clinical investigations in order to clarify the pathology of riboflavin transporter (RFVT) deficiency. The data using the mice and culture cells showed that RFVT2 is expressed in the small intestine and mediates the uptake of riboflavin into intestinal epithelial cells. In addition, in the collaboration with foreign groups, it was suggested that the deficiency of RFVT2 as well as RFVT3 causes Brown-Vialetto-Van Laere syndrome (BVVLS). These results can help to clarify the pathology and develop the therapeutic strategy for BVVLS.

L-dopa remains the gold standard for treating Parkinson's disease (PD); however, long-term L-dopa treatment is associated with motor adverse effects, particularly wearing-off. Entacapone prevents catechol-O-methyltransferase (COMT) from metabolizing L-dopa into 3-methoxy-4-hydroxy-L-phenylalanine in the periphery and ameliorates wearing-off in patients with PD treated with L-dopa for a prolonged period. In the present study, we examined whether the blood concentration of L-dopa was affected by COMT gene polymorphisms in patients taking L-dopa concomitantly with entacapone. We demonstrated that entacapone did not change the area under the blood concentration-time curve of L-dopa in PD patient who had a low-activity COMT gene. This result suggests that the blood concentration of L-dopa taken concomitantly with entacapone is affected by the COMT gene polymorphism.

Riboflavin (Vitamin B2) is a orange-yellow water-soluble vitamin, which plays important roles in the metabolism of glucose, amino acids and lipids. In the present study, we analyzed the pathology of the disruption in riboflavin transporter RFVT gene. It was revealed that the disruption of RFVT gene induced metabolic disorders, caused by riboflavin deficiency, in mice. These results will contribute to the development of therapy in RFVT-genetic rare diseases.

研究計画初年度である平成19年度では、単離尿細管という極微量試料を用いた網羅的遺伝子発現解析の手法を確立した。また、シスプラチン投与による尿細管障害モデルおよびGFR低下モデルを作成した。平成20年度には腎障害モデルラットにおける単離尿細管遺伝子発現プロファイルの構築と尿細管由来の腎障害メディエイターの探索へと進展できると考える。 (1)単離尿細管を用いた遺伝子発現プロファイルの構築と評価 ラット腎臓より近位尿細管20mmを単離し、DIGラベルcRNAを7-10ug作成した。DNAアレイ解析にはGenome Survey MicroarrayRを用い、尿細管遺伝子発現プロファイルを構築した。シグナル/ノイズ比3.0以上を基準として全27,000遺伝子のうち約10,000遺伝子が検出され、本実験系により単離尿細管の網羅的遺伝子発現解析が可能であることが示された。さらに、近位尿細管上皮細胞に発現することが報告されているSlc22a1,5,8のシグナルは単離尿細管を用いることでwhole kidneyと比べ有意に強く、単離尿細管遺伝子発現解析の有用性が明らかになった。 (2)腎機能障害モデルラットの作成 シスプラチンの腎特異的な毒性発現機構として、近位尿細管特異的に発現する有機カチオントランスポータOCT2が規定因子となることを明らかにした。さらに、2mg/kgのシスプラチン投与によりKim-1の発現および尿中NAG活性の上昇をきたす尿細管障害モデルを、10mg/kgのシスプラチン投与によりGFR低下をきたす腎機能障害モデルを作成できることを示した。