共同研究・競争的資金等の研究課題

放射線はヒト体内にあるDNAに対して様々な形状の損傷を与える。その多様なDNA損傷の中で、DNA二重鎖が同時に切断されるDNA二本鎖切断は最も重篤なDNA損傷の一つとされている。一方で人体は、傷ついたDNAを復元する「DNA修復」という機能を持つことから、正確にDNAを修復できるかどうかがその後の人体の運命決定に大きな影響を与える。本研究ではDNA修復の精度に関わる最重要分子である53BP1を対象に、その詳細な分子機構解明に挑戦する。人体がどのようにして正確なDNA修復を実現するか、その仕組みを明らかにすることで、放射線障害の低減に貢献することができると考えている。

我々のこれまでの研究成果から、DNA損傷後のシグナル伝達が、転写及び翻訳の変化を引き起こし、非自己となる抗原（ネオアンチゲン）を産生しているという新たなモデルを考案している。そこで本研究では、「ゲノム変異非依存的なネオアンチゲン産生機構」の立証およびその分子機構解明を目的として、DNA損傷依存的な転写および翻訳開始点の変化を検出および解析する。DNA損傷という細胞に過度なストレスを与えた環境においては、従来の定説とは異なる抗原産生メカニズムが働くという新しい生命応答を示すことができ、当該分野における新たな概念を世界に先駆けて発信することができると考えている。

翻訳停滞とは，翻訳中にリボソームがmRNA上で停滞して蛋白質合成が滞る状態を指す。ミトコンドリアの翻訳系には，2種類の翻訳停滞解消因子「C12orf65」および「ICT1」が必ず存在するが，長らくC12orf65とICT1の機能的差異については不明であった。申請者は出芽酵母を用いた実験により，C12orf65が「リボソーム結合性抗生物質による翻訳停滞」の解消に必須であることを明らかにした。本研究では，ミトコンドリアにとって内在的リスク因子である酸化ストレスに着目し，酸化ストレスに対するミトコンドリア翻訳停滞解消システムの役割の解明を行う。

高LET(linear energy transfer: 線エネルギー付与)線は、X線などの低LET線よりも複雑な構造のDNA二本鎖切断(double-strand break: DSB)を誘発する。ヒト細胞は非相同末端連結、相同組換え、代替末端連結の3つのDSB修復経路を備えているが、高LET線誘発DSBの修復を担う経路や修復に伴うゲノム情報の変化は不明である。本研究では、高LET線誘発DSBの修復に重要な経路の選択性や修復異常によって生じる染色体異常の特徴を明らかにし、高LET線誘発DSBの修復機構研究の推進と、放射線医学や宇宙医学における個人に最適化した放射線防護の設定に貢献する。 高LET(linear energy transfer: 線エネルギー付与)線は、X線などの低LET線よりも複雑な構造のDNA二本鎖切断(double-strand break: DSB)を誘発する。ヒト細胞は非相同末端連結、相同組換え、代替末端連結の3つのDSB修復経路を備えているが、高LET線誘発DSBの修復を担う経路や修復に伴うゲノム情報の変化は不明である。高LET線誘発DSBによる影響を明らかにするため、今年度はHT1080より作製した遺伝子破壊株の重粒子線とX線の感受性を解析した。 HT1080より作製した遺伝子破壊株を用いて、研究計画にしたがっておおむね実施することができたため。 重粒子線を照射したHT1080由来遺伝子破壊株の染色体を解析し、X線照射による染色体異常との比較や修復経路欠損による特徴を明らかにする。

組織の発がん過程における放射線および化学物質など環境因子による影響を、生物学的に共通の指標であるゲノムストレス（DNA損傷）と炎症の観点から理解する。研究代表者が開発したDNA損傷可視化マウスや、臓器培養（オルガノイド培養）することで、炎症・抗炎症に寄与する免疫・炎症関連の化合物スクリーニングを行う。これにより、発がんの初期過程であるゲノムストレスと、がん進展過程（プロモーション）である微小環境における炎症の同時評価を可能とし、様々な環境因子の発がんリスクを共通の指標で相互比較可能な本研究のプラットフォームを活用して、組織フィールド内での発がんプロセスの解明を目指す。

重粒子線照射は局所集中的に多様なDNA損傷(クラスター損傷)を誘発すると考えられているが、未だ細胞レベルでクラスター損傷の可視化は出来ていない。本研究では次世代3D超高解像度顕微鏡を用いて重粒子線誘発DNA損傷の可視化を試みた。重粒子線誘発DNA二本鎖切断(DSB)の可視化には、DSB末端の一本鎖DNA領域に集積するRPA fociをマーカーとして用いた。我々は重粒子線が通過した軌道上に非常に近接して複数個のRPA fociが存在することを見出した。このような近接した複数のDSBの生成は、重粒子線特異的であり、X線と比較した際の高い染色体異常や細胞致死性を導く要因となることが示唆された。

発がんに大きく関わる染色体転座は、DNA二本鎖切断（DSB: DNA double strand break）の修復エラーにより生じる。しかしながら、発がんに繋がる遺伝子領域間での染色体転座がどのような過程で生じるかは未だ多くが明らかになっていない。申請者は、DSB修復の際のRloop解消異常が染色体転座に関わることを示唆するデータを得ている（Yasuhara et al. &Shibata*, Cell, 2018）。しかしながら、転写共役型DSB修復と遺伝子領域間転座を繋ぐ分子メカニズムの解明までには至っていない。そこで本研究課題では、任意の場所とタイミングでDSBを人為的に誘導するヒト培養細胞実験系を確立し、転写活性を有する遺伝子間における染色体転座アッセイ系を構築することで、染色体転座を引き起こす分子機構解明に迫る。また本研究のもう一つの挑戦として、ヒト体細胞の大半を占めるにも関わらず、これまで解析が困難であったヒト静止期G0/G1期細胞を研究対象とする。今年度はタモキシフェン誘導体4OHTにて制限酵素AsiSIが核内に誘導されるシステムを、網膜色素上皮細胞（RPE細胞：Retinal Pigment Epithelium）において構築し、またDSB発生を停止させるためのAIDタグ法を組み合わせた実験系を確立した。RPE細胞は接触阻害法によりG0/G1期に同調することができ、G0/G1期に4OHTを処理することでDSBを誘導することに成功した。これらのアッセイ系を用いて染色体転座アッセイ系の構築を中心に行い、染色体転座が起こりやすいDSB部位の組み合わせの同定を試みている。またDSB修復に関わる因子のノックダウンを行い、どの転座領域でどのようなDNA修復因子が関わるかを明らかにしようとしている。

放射線治療では、がん細胞のDNA修復機構は治療効果を妨げるためDNA修復の人為的制御が望まれる。重粒子線は照射対象に集中的にエネルギーを付与する高LET(線エネルギー付与)の性質を持つ放射線であり、重粒子線によるDNA損傷は末端が複雑な二重鎖切断が形成され、修復されにくい。当課題では、重粒子線によるDNA損傷であっても、休止期のがん細胞では、ゆっくりと修復されることを見いだし、その修復経路に特徴的に働く因子群を特定した。特に、ヒストン修飾酵素RNF8が特異的に働くことと、RNF8の機能阻害に放射線治療の効果を高め、がんの再発を防ぐ効果が期待できることを明らかにした。

DNAの二本鎖切断（DSB）は非常に細胞毒性の強いDNA損傷であり、抗がん剤によっても誘導され、がん細胞を殺す目的で使用される。抗がん剤カンプトテシン（CPT）は、増殖している細胞においてDNAの複製を介してDSBを誘導する。しかし、DNA複製を介したDSB（RM-DSB）に対する細胞応答はよくわかっていなかった。本研究では、RM-DSBの修復経路の制御メカニズムを解析した結果、翻訳後修飾の一つであるユビキチン化を調節する因子であるUbcH5cがRM-DSBの修復経路に関与しており、染色体異常を引き起こすことを明らかにした。

染色体転座メカニズムの解明を目的とし、LacO-I-SceI-TetO細胞株を樹立して新規転座アッセイ系の構築を試みたが、技術的な問題点により、最終的に作製はできなかった。一方で重粒子線ではX線照射に比べ高い頻度で染色体転座が引き起こされる点に注目し、重粒子線照射後の転座発生メカニズムの解析を試みた。染色体領域とDSB部位をそれぞれFISHと蛍光抗体法により可視化して解析し、重粒子線照射細胞では複数の染色体にまたがった形状の特徴的なDNA損傷形態が観察されることを明らかにした。この特徴的DNA損傷では、染色体転座の初期段階であるDNA末端の削りこみがおこっていることが示された。

放射線照射によって生じるDNA二本鎖切断は最も重篤なDNA損傷であり、その修復の成否は細胞の生死に大きな影響を与える。本研究では、DNA二本鎖切断の修復経路の一つである相同組換え（HR）に着眼し、HR開始に関わる新規因子を同定するためスクリーニングを行った。その結果、転写のみならずHRにも関わる新規HR因子を同定した。同定されたMEC1およびREC1は、HR開始を導くDSB end resectionを促進することが明らかになった。これらの発見は、放射線照射が誘発するゲノム安定化機構を理解する重要な分子情報基盤となる。

抗がん剤であるカンプトテシン（CPT）は、DNA切断端を一つしか持たない損傷（one-ended DSB）を生じる。one-ended DSBの修復に非相同末端連結（NHEJ）が関与すると細胞にとって毒性を示すと考えられ、CPTによる抗がん効果を考える上では、one-ended DSBに対するNHEJ経路の関与機構を明らかにすることは重要となる。 これまでの研究から、ユビキチン化因子であるUbcH5がNHEJに関与し、染色体異常の発生や、CPTへの抵抗性に寄与することを見出した。E3ユビキチンリガーゼとしてSIAH1 も同定したが、UbcH5とは異なる影響が見られた。

ParpのDSB修復への関与を検討するため、2006年4月よりDSB修復研究の権威である英国サセックス大学Prof.Penny Jeggo研究室において研究を行った。 Jeggo研究室では、DSB切断後にリン酸化され細胞内でフォーカスを形成するH2AXをDSBのマーカーとして用いている。放射線照射後にリン酸化H2AX(γ-H2AX)の抗体を用い免疫蛍光染色した後、γ-H2AX fociを計測することによりDSBの絶対数を評価する。Parpファミリーの中でもParp-1及びParp-2がDNA切断端に結合し活性化されることが知られているため、本研究では双方の活性を阻害するParp阻害剤を用いてNHEJへの関与を検討した。放射線照射後のDSBは、G1期においてNHEJのみで修復されることが知られているため、G1期に同調後、放射線照射後のγ-H2AX fociを計測した。DNA-PK、Ku80及びDNA ligaseIV欠損細胞では顕著なγ-H2AX fociの消失遅延が認められたが、野生型細胞に対するParp阻害剤の添加ではγ-H2AX fociの消失遅延は認められなかった。DNA-PK、Ku80及びDNAligaselV欠損細胞にParp阻害剤を添加したところ、Ku80欠損細胞においてのみ放射線照射後のγ-H2AX fociの消失が全く認められなかった。NHEJに関与することが近年発見されたXLFの欠損細胞に対してParp阻害剤の効果を検討した。XLF欠損細胞はγ-H2AX fociの消失遅延を示すが、Parp阻害剤の添加はさらなる遅延を示した。以上の結果から、Parp阻害剤はKu80及びXLF欠損下におけるDSB修復を抑制したため、DSB後のParpの活性化はKu80及びXLF欠損下でのNHEJのバックアップ経路を促進している可能性が考えられた。

本研究は、免疫から逃避している腫瘍に、抗腫瘍免疫を起動する遺伝子を導入し、惹起された免疫機構により腫瘍を排除する新規がん治療法の開発を目的としている。本研究では、全身投与が可能であり、定的に腫瘍に遺伝子を導入する人工ウィルス(非ウィルス型ベクター）を用い、腫瘍の免疫原性を高める遺伝子を腫瘍に強制発現させる。そして、人工ウィルスの有効性、すなわち腫瘍特異的遺伝子導入率・抗腫瘍免疫の賦活化・腫瘍増殖の抑制効果を検証する。本研究で提案する治療法は、全ての腫瘍において適応可能であり、従来の免疫療法との併用によりそれぞれの奏功の最大化も期待できる新規免疫療法である。

植物幹細胞は多能性の維持において独自のゲノム制御システムを有している。植物幹細胞はDNA損傷に対して高感受性を示すが、細胞死に至るまでのシグナル応答は多くが未解明である。これまでの研究から、植物幹細胞が DNA 損傷を受けた場合、オーキシン発現量の低下に伴うクロマチン弛緩が生じることが明らかになりつつある。本研究では、動物細胞を植物研究のモデル生物として用い、幹細胞における DNA損傷発生、修復経路、そして細胞死までの分子機構を解明することで、動植物幹細胞ゲノム維持機構の共有性と独自性の統合的理解に迫る。本年度は、細胞の運命を左右する重篤なDNA損傷の一つであるDNA二本鎖切断（DSB）後の損傷応答に着目し、DSB誘導後のクロマチン構造変化とDSBマーカーの局在性を、超高解像度蛍光顕微鏡 3D-SIM を用いて解析した。また、クロマチン弛緩時のDNA損傷発生量と修復経路を検討するために、クロマチン制御因子をノックダウンし、DNA 損傷量および DNA 修復経路の解析を進めている。さらに、DNA損傷後のクロマチン構造変換に影響を及ぼす分子機構を解明すべく、DNA損傷後の遺伝子発現をRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った。その結果、分化した細胞ではCAF-1, HP-1, KAP-1の顕著な低下が認められた。これまでの検討は分化したヒト網膜色素上皮細胞（RPE細胞：Retinal Pigment Epithelium）を用いて行っており、次年度からマウスES細胞を使って幹細胞における損傷応答反応を解析する。

DSBマーカーとして用いているγH2AXが様々な形状をしていることは多くの研究者が気付いているが、その理由と役割については全く研究が行われていない。γH2AXがなぜ大きくなるのか、なぜ小さいフォーサイが存在するのか、そしてγH2AXの大きさはDNA修復の正確性を保証するのか、γH2AX構造の破綻はゲノム不安定化を導くのか、これらの問いに答える研究は未だ国際的にも報告例が無い。したがって、本研究課題は当該分野を専門とする研究者ですら答えることができない謎であり、学術的に核心をなす問いであると考えている。

ライブセルイメージングでDNA損傷と細胞周期を同時にモニタリングできる細胞株を樹立し、X線及び重粒子線照射後120時間以上のタイムラプス実験を行った。X線照射細胞では照射後複数回の細胞分裂により重篤なゲノム不安定化が増加し、細胞死に至った。一方重粒子線照射細胞では、照射後すぐの細胞分裂後から効率的に細胞死が引き起こされ、更に細胞分裂自体もX線照射に比べて抑制された。これらの結果から、X線照射細胞では、照射後の細胞分裂を通じた細胞周期進行に伴って一定期間後にその生死の運命決定がなされるのに対し、重粒子線照射細胞では、照射直後に細胞死に向かう運命決定がなされている可能性が示された。