Research projects

DNA double-strand breaks (DSBs) induced by radiation exposure (IR) are considered one of the most severe forms of DNA damage, and the success or failure of their repair has a significant impact on cellular fate. After IR, chromatin structural changes occur appropriately in the vicinity of DSBs, facilitating efficient DSB repair. However, the detailed molecular mechanisms underlying this process remain unclear. In this study, we focused on 53BP1 to investigate how cells optimize the chromatin environment around DSBs. Using super-resolution fluorescence microscopy (3D-SIM), we found that 53BP1 forms multiple nanodomains, and discovered that 53BP1 oligomerization plays a crucial role in DNA damage signaling, including γH2AX focus formation.

我々のこれまでの研究成果から、DNA損傷後のシグナル伝達が、転写及び翻訳の変化を引き起こし、非自己となる抗原（ネオアンチゲン）を産生しているという新たなモデルを考案している。そこで本研究では、「ゲノム変異非依存的なネオアンチゲン産生機構」の立証およびその分子機構解明を目的として、DNA損傷依存的な転写および翻訳開始点の変化を検出および解析する。DNA損傷という細胞に過度なストレスを与えた環境においては、従来の定説とは異なる抗原産生メカニズムが働くという新しい生命応答を示すことができ、当該分野における新たな概念を世界に先駆けて発信することができると考えている。

翻訳停滞とは，翻訳中にリボソームがmRNA上で停滞して蛋白質合成が滞る状態を指す。ミトコンドリアの翻訳系には，2種類の翻訳停滞解消因子「C12orf65」および「ICT1」が必ず存在するが，長らくC12orf65とICT1の機能的差異については不明であった。申請者は出芽酵母を用いた実験により，C12orf65が「リボソーム結合性抗生物質による翻訳停滞」の解消に必須であることを明らかにした。本研究では，ミトコンドリアにとって内在的リスク因子である酸化ストレスに着目し，酸化ストレスに対するミトコンドリア翻訳停滞解消システムの役割の解明を行う。

High Linear Energy Transfer (LET) radiation induces DNA double-strand breaks (DSBs) with more complex structures than DSBs induced by low LET radiation such as X-rays. Although human cells possess three DSB repair pathways: nonhomologous end-joining, homologous recombination, and alternative end-joining, the entire mechanism of repair of high-LET radiation-induced DSBs remains unclear. In this study, we aimed to elucidate the pathways responsible for the repair of high-LET radiation-induced DSB in human cells. Using human gene knockout cell lines lacking the DSB repair pathway(s), we obtained novel findings that differ from our initial expectations regarding the selectivity of the repair pathway that is important for the repair of high-LET radiation-induced DSB.

組織の発がん過程における放射線および化学物質など環境因子による影響を、生物学的に共通の指標であるゲノムストレス（DNA損傷）と炎症の観点から理解する。研究代表者が開発したDNA損傷可視化マウスや、臓器培養（オルガノイド培養）することで、炎症・抗炎症に寄与する免疫・炎症関連の化合物スクリーニングを行う。これにより、発がんの初期過程であるゲノムストレスと、がん進展過程（プロモーション）である微小環境における炎症の同時評価を可能とし、様々な環境因子の発がんリスクを共通の指標で相互比較可能な本研究のプラットフォームを活用して、組織フィールド内での発がんプロセスの解明を目指す。

Heavy-ion radiation induces clustered DNA damage, which contains multiple type of DNA damage, e.g. DNA double strand break (DSB), single strand break and base damage. However so far, such clustered DNA damage has not been visualized in the cellular level. Here we aimed to visualize the clustered DNA damage, particularly about the formation of DSB, after heavy-ion radiation by using 3D super-resolution microscopy. To address the question whether heavy-ion irradiation generates clustered DSB formation or not, we monitored RPA foci as a DSB marker. The super-resolution analysis revealed that heavy-ion radiation induced multiple RPA foci in close proximity. Furthermore, our analysis demonstrated that the distance between two individual RPA foci within γH2AX foci was approximately 700 nm. In summary, our data suggests that these closely localized DSBs are considered to be a risk for chromosomal translocations, deletions and cell death after heavy-ion irradiation.

発がんに大きく関わる染色体転座は、DNA二本鎖切断（DSB: DNA double strand break）の修復エラーにより生じる。しかしながら、発がんに繋がる遺伝子領域間での染色体転座がどのような過程で生じるかは未だ多くが明らかになっていない。申請者は、DSB修復の際のRloop解消異常が染色体転座に関わることを示唆するデータを得ている（Yasuhara et al. &Shibata*, Cell, 2018）。しかしながら、転写共役型DSB修復と遺伝子領域間転座を繋ぐ分子メカニズムの解明までには至っていない。そこで本研究課題では、任意の場所とタイミングでDSBを人為的に誘導するヒト培養細胞実験系を確立し、転写活性を有する遺伝子間における染色体転座アッセイ系を構築することで、染色体転座を引き起こす分子機構解明に迫る。また本研究のもう一つの挑戦として、ヒト体細胞の大半を占めるにも関わらず、これまで解析が困難であったヒト静止期G0/G1期細胞を研究対象とする。今年度はタモキシフェン誘導体4OHTにて制限酵素AsiSIが核内に誘導されるシステムを、網膜色素上皮細胞（RPE細胞：Retinal Pigment Epithelium）において構築し、またDSB発生を停止させるためのAIDタグ法を組み合わせた実験系を確立した。RPE細胞は接触阻害法によりG0/G1期に同調することができ、G0/G1期に4OHTを処理することでDSBを誘導することに成功した。これらのアッセイ系を用いて染色体転座アッセイ系の構築を中心に行い、染色体転座が起こりやすいDSB部位の組み合わせの同定を試みている。またDSB修復に関わる因子のノックダウンを行い、どの転座領域でどのようなDNA修復因子が関わるかを明らかにしようとしている。

Heavy ions induce multiple closely localised double strand break sites (Clustered DSBs). The clustered DSBs are repaired dependently by E3 ubiquitin ligase RNF8. RNF8 is known as a DNA repair factor within the heterochromatin (HC) region. We found that HC-building factor siKAP1 did not affect the repair defect in RNF8 knockdown cells post Fe ions irradiation. This suggests that RNF8 is required for clustered DSBs repair following heavy ion irradiation not only in HC-regions but also in euchromatin regions. It is also known that RNF8 recruits 53BP1 and BRCA1 to DSB sites. The repair of clustered DSBs in 53BP1 knockdown cells were impaired to similar levels as the defect in RNF8 knockdown cells, whereas no repair defect was observed in BRCA1 knockdown cells. Taken together, clustered DSBs induced by heavy ions are repaired by RNF8-53BP1 dependent pathway.

DNA double-strand breaks (DSBs) are severe DNA damage that can be caused by anti-cancer drug to kill cancer cells. Camptothecin (CPT) causes DSB via DNA replication in growing cells. However, cellular responses to DNA replication-mediated DSB (RM-DSB) had not been revealed. In this study, we analyzed regulatory mechanisms of RM-DSB repair pathway and discovered that UbcH5c, a E2 ubiquitin-conjugating enzyme, is involved in NHEJ pathway of RM-DSB repair leading to chromosomal aberration.

We established LacO-I-SceI-TetO cell line and tried to set up a new system for monitoring chromosomal translocation, however unfortunately, it was not working well because of technical problems. It is well known that the particle irradiation more frequently causes chromosomal translocation compared with X-ray irradiation. Therefore we simultaneously visualized the site of IR-induced DSBs and chromosome position by combining Immunofluorescence and FISH after C-ion or X-rays irradiation. We found that the frequency of gH2AX foci at the chromosome boundary of chromosome 1 after C-ion irradiation was >4-fold higher than that after X-ray irradiation, and gH2AX foci at chromosome boundaries after C-ion irradiation contain DSBs undergoing DNA-end resection, which promotes repair utilizing microhomology mediated end-joining during translocation. These data suggest that the spatial proximity between breaks is an important factor in translocation formation.

Ionizing irradiation causes DNA double strand breaks, which can lead to cell death if unrepaired or misrepaired. In the present study, to identify a novel factor promoting HR at the step of DSB end resection, we carried out a screening experiment. Importantly, our analysis demonstrated that novel HR factors, MEC1 and REC1, which are originally involved in transcription, promote the initiation of HR by activating the step of DSB end resection. This finding provides us important information regarding the maintenance of genome stability after ionizing irradiation.

Anti-cancer drug camptothecin (CPT) causes DNA double-strand break (DSB) containing a single-DNA end that is referred to as one-ended DSB. Given that contribution of non-homologous end joining (NHEJ) to the repair of one-ended DSBs are considered to sensitize cells to CPT, it is important to reveal the mechanism of NHEJ contribution to the repair of one-ended DSBs for consideration of CPT efficacy in the chemotherapy. Several researches suggested that UbcH5 is involved in the appearance of chromosome aberrations and CPT-resistance via NHEJ. SIAH1 was also identified as E3 ubiquitin ligase that is involved in NHEJ activation, but it has showed different phenotypes from UbcH5 so far.

ParpのDSB修復への関与を検討するため、2006年4月よりDSB修復研究の権威である英国サセックス大学Prof.Penny Jeggo研究室において研究を行った。 Jeggo研究室では、DSB切断後にリン酸化され細胞内でフォーカスを形成するH2AXをDSBのマーカーとして用いている。放射線照射後にリン酸化H2AX(γ-H2AX)の抗体を用い免疫蛍光染色した後、γ-H2AX fociを計測することによりDSBの絶対数を評価する。Parpファミリーの中でもParp-1及びParp-2がDNA切断端に結合し活性化されることが知られているため、本研究では双方の活性を阻害するParp阻害剤を用いてNHEJへの関与を検討した。放射線照射後のDSBは、G1期においてNHEJのみで修復されることが知られているため、G1期に同調後、放射線照射後のγ-H2AX fociを計測した。DNA-PK、Ku80及びDNA ligaseIV欠損細胞では顕著なγ-H2AX fociの消失遅延が認められたが、野生型細胞に対するParp阻害剤の添加ではγ-H2AX fociの消失遅延は認められなかった。DNA-PK、Ku80及びDNAligaselV欠損細胞にParp阻害剤を添加したところ、Ku80欠損細胞においてのみ放射線照射後のγ-H2AX fociの消失が全く認められなかった。NHEJに関与することが近年発見されたXLFの欠損細胞に対してParp阻害剤の効果を検討した。XLF欠損細胞はγ-H2AX fociの消失遅延を示すが、Parp阻害剤の添加はさらなる遅延を示した。以上の結果から、Parp阻害剤はKu80及びXLF欠損下におけるDSB修復を抑制したため、DSB後のParpの活性化はKu80及びXLF欠損下でのNHEJのバックアップ経路を促進している可能性が考えられた。

本研究は、免疫から逃避している腫瘍に、抗腫瘍免疫を起動する遺伝子を導入し、惹起された免疫機構により腫瘍を排除する新規がん治療法の開発を目的としている。本研究では、全身投与が可能であり、定的に腫瘍に遺伝子を導入する人工ウィルス(非ウィルス型ベクター）を用い、腫瘍の免疫原性を高める遺伝子を腫瘍に強制発現させる。そして、人工ウィルスの有効性、すなわち腫瘍特異的遺伝子導入率・抗腫瘍免疫の賦活化・腫瘍増殖の抑制効果を検証する。本研究で提案する治療法は、全ての腫瘍において適応可能であり、従来の免疫療法との併用によりそれぞれの奏功の最大化も期待できる新規免疫療法である。

植物幹細胞は多能性の維持において独自のゲノム制御システムを有している。植物幹細胞はDNA損傷に対して高感受性を示すが、細胞死に至るまでのシグナル応答は多くが未解明である。これまでの研究から、植物幹細胞が DNA 損傷を受けた場合、オーキシン発現量の低下に伴うクロマチン弛緩が生じることが明らかになりつつある。本研究では、動物細胞を植物研究のモデル生物として用い、幹細胞における DNA損傷発生、修復経路、そして細胞死までの分子機構を解明することで、動植物幹細胞ゲノム維持機構の共有性と独自性の統合的理解に迫る。本年度は、細胞の運命を左右する重篤なDNA損傷の一つであるDNA二本鎖切断（DSB）後の損傷応答に着目し、DSB誘導後のクロマチン構造変化とDSBマーカーの局在性を、超高解像度蛍光顕微鏡 3D-SIM を用いて解析した。また、クロマチン弛緩時のDNA損傷発生量と修復経路を検討するために、クロマチン制御因子をノックダウンし、DNA 損傷量および DNA 修復経路の解析を進めている。さらに、DNA損傷後のクロマチン構造変換に影響を及ぼす分子機構を解明すべく、DNA損傷後の遺伝子発現をRNA-seqによるトランスクリプトーム解析を行った。その結果、分化した細胞ではCAF-1, HP-1, KAP-1の顕著な低下が認められた。これまでの検討は分化したヒト網膜色素上皮細胞（RPE細胞：Retinal Pigment Epithelium）を用いて行っており、次年度からマウスES細胞を使って幹細胞における損傷応答反応を解析する。

DSBマーカーとして用いているγH2AXが様々な形状をしていることは多くの研究者が気付いているが、その理由と役割については全く研究が行われていない。γH2AXがなぜ大きくなるのか、なぜ小さいフォーサイが存在するのか、そしてγH2AXの大きさはDNA修復の正確性を保証するのか、γH2AX構造の破綻はゲノム不安定化を導くのか、これらの問いに答える研究は未だ国際的にも報告例が無い。したがって、本研究課題は当該分野を専門とする研究者ですら答えることができない謎であり、学術的に核心をなす問いであると考えている。

We established a cell line for monitoring DNA damages with cell cycle status to applied live cell imaging microscopy over 120 h as a more direct approach for tracking cell fate after irradiation. The time-lapse experiments showed that X-ray irradiated cells were required to pass a couple of cell cycle to undergo cell death (CD), however interestingly, C-ion induced CD were mostly occurred at the interphase following 1st mitosis. Also, the number of total mitosis after C-ion irradiation is much decreased than that after X-rays irradiation. These data suggest that C-ion irradiation causes lethal damages before the completion of 1st mitosis so that the fate of C-ion irradiated cells is decided to die at the time. In contrast, X-ray irradiated cells traverse the cell cycle and enter mitosis in the presence of unrepaired or misrepaired DSBs, consequently, chromosomal aberrations are acumulated, resulting in cell lethality with cell cycle progressions.