総説・解説等

【背景】 神経幹細胞はニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトに分化できる多分化能を持つ細胞であり，神経幹細胞の分化・増殖においてはbasic helix-loop-helix (bHLH) 型転写因子が重要な働きをしている（図1）．Hairy and enhancer of split 1 (Hes1) , Hes5は抑制型のbHLH因子であり，Mash1やNgn2などの分化を促進する活性型bHLH因子の転写を抑制することで神経幹細胞を未分化のまま維持している．Hes1, Hes5の発現は，Notchシグナル伝達経路により制御されることが知られている． Notchシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化において重要な役割を担っている経路である1)（図2）．Notchは細胞膜上に発現する受容体であり，隣接する細胞上に存在するリガンドであるDeltaやJaggedが結合することで，内在性のg-セクレターゼによってNotch細胞内ドメイン（NICD）が切断される．NICDは核内に移行し，DNA結合タンパク質であるRBP-J, MAMLと安定な複合体を形成することで標的遺伝子であるHes1, Hes5の転写を活性化している．そのため，Notchシグナルを阻害する化合物は，Hes1やHes5の発現を抑制，神経幹細胞の分化を誘導し，新たな神経再生医薬の候補となることが期待される． 【レポーターアッセイ系の構築】 Notchシグナル阻害活性を評価するため，以前に岡本らが構築したNICD安定発現株2)（ヒト結腸腺癌細胞LS174T）を用いてレポーターアッセイ系の構築を行った（図3）．RBP-J結合配列を12個有するルシフェラーゼプラスミドを作製後，安定発現株を得た．本アッセイ系では通常時，テトラサイクリンリプレッサー（TetR）によってNICDの発現が抑制されている．ドキシサイクリン（Dox）を添加することで，TetRが解離し，NICDのN末端に40アミノ酸残基が結合したNotchDEが発現する．NotchDEは内在性のg-セクレターゼによって切断され，NICDが生じる．NICDは核内に移行し，RBP-J, MAMLと安定な複合体を形成することで下流のルシフェラーゼ遺伝子を転写する．ルシフェラーゼ活性を測定することで，NICDの転写活性を定量する． 構築したアッセイ系を用いて当研究室保有のタイ産植物エキスライブラリーについてスクリーニングを行い，良好な活性を示したフクギ科(View PDFfor the rest of the abstract.)

【背景】 神経幹細胞はニューロン，アストロサイト，オリゴデンドロサイトに分化できる多分化能を持つ細胞であり，神経幹細胞の分化・増殖においてはbasic helix-loop-helix (bHLH) 型転写因子が重要な働きをしている（図1）．Hairy and enhancer of split 1 (Hes1) , Hes5は抑制型のbHLH因子であり，Mash1やNgn2などの分化を促進する活性型bHLH因子の転写を抑制することで神経幹細胞を未分化のまま維持している．Hes1, Hes5の発現は，Notchシグナル伝達経路により制御されることが知られている． Notchシグナル伝達経路は細胞の増殖や分化において重要な役割を担っている経路である1)（図2）．Notchは細胞膜上に発現する受容体であり，隣接する細胞上に存在するリガンドであるDeltaやJaggedが結合することで，内在性のg-セクレターゼによってNotch細胞内ドメイン（NICD）が切断される．NICDは核内に移行し，DNA結合タンパク質であるRBP-J, MAMLと安定な複合体を形成することで標的遺伝子であるHes1, Hes5の転写を活性化している．そのため，Notchシグナルを阻害する化合物は，Hes1やHes5の発現を抑制，神経幹細胞の分化を誘導し，新たな神経再生医薬の候補となることが期待される． 【レポーターアッセイ系の構築】 Notchシグナル阻害活性を評価するため，以前に岡本らが構築したNICD安定発現株2)（ヒト結腸腺癌細胞LS174T）を用いてレポーターアッセイ系の構築を行った（図3）．RBP-J結合配列を12個有するルシフェラーゼプラスミドを作製後，安定発現株を得た．本アッセイ系では通常時，テトラサイクリンリプレッサー（TetR）によってNICDの発現が抑制されている．ドキシサイクリン（Dox）を添加することで，TetRが解離し，NICDのN末端に40アミノ酸残基が結合したNotchDEが発現する．NotchDEは内在性のg-セクレターゼによって切断され，NICDが生じる．NICDは核内に移行し，RBP-J, MAMLと安定な複合体を形成することで下流のルシフェラーゼ遺伝子を転写する．ルシフェラーゼ活性を測定することで，NICDの転写活性を定量する． 構築したアッセイ系を用いて当研究室保有のタイ産植物エキスライブラリーについてスクリーニングを行い，良好な活性を示したフクギ科(View PDFfor the rest of the abstract.)

Neural stem cells (NSCs) can differentiate to neural cells such as neurons and astrocytes, therefore regenerative medicine based on natural products are urgent to neural diseases. We recently focused on the basic helix-loop-helix (bHLH) transcriptional factors, which control proliferation and differentiation of NSCs. To quickly find the ligands of bHLH factors from natural products extract, we developed the Hes I immobilized sepharose beads-HPLC method. Flavonoid glycosides (1-3) have been isolated rapidly by this method. Compounds 1 and 3 had the inhibitory activity against the Hes 1 dimer formations, and accelerated the neuron differentiation of mouse neural stem cells (MEB5). As a "natural products + diversity-oriented synthesis (DOS)" derived library, the heterocyclic-substituted chromones or flavonoids library was constructed by our efficient synthesis method and solid phase synthesis. By constructed cell-based assay, several compounds were found as moderate Hes 1 promoter inhibitors. Compound 4 actually inhibited Hes 1 mRNA expression in NSCs. Interestingly, 4 led the NSCs to astrocyte selective differentiation. We also searched upregulators of Ngn2 expression, which is bHLH differentiation activator. The cell-based assay for Ngn2 promoter activity was constructed. By Ngn2 promoter activity guided separation, several activators were isolated from Butea superba. Of them, three compounds (5-7) showed neuron selective differentiation of NSCs.

[GRAPHICS]A chiral bis(isoxazoline) ligand (SPRIX) containing a rigid spiro skeleton was designed and synthesized via a double intramolecular nitrile oxide cycloaddition, The optically pure SPRIX greatly accelerated the Cu(acac)(2)-catalyzed asymmetric reaction of diisopropylzinc with cyclohexenone to give the Michael adduct with 49% ee. This is the first example of the use of an isoxazoline ligand for a transition metal catalyzed reaction. The X-ray crystallographic analysis of the hexacoordinated copper complex of SPRIX confirmed the ligand character.

The first chiral isoxazoline ligands bearing spiro skeleton are developed. The spiro bis(isoxazoline) ligands (SPRIXs) are readily synthesized from diethyl malonate via double intramolecular nitrile oxide cycloaddition as a key step. The complex of (M, S, S)-R-SPRIX and Pd(OCOCF3)(2) promoted the catalytic asymmetric Wacker-type cyclization of alkenyl alcohols to give optically active cyclic ethers for the first time. Furthermore, starting from dialkenyl alcohol, the enantioselective tandem cyclization via oxy-palladation was achieved with up to 95% ee. Asymmetric ligands other than SPRIXs promote neither the Wacker-type reaction nor the tandem reaction.

Combination of Pd(OCOCF3)(2) and (M,S,S)-iPr-SPRIX ligand promoted the intramolecular cyclization of 2-alkynoates very effectively to form alpha-methylene-gamma-butyrolactones in good yields with up to 92% ee. (C) 2003 Elsevier Science Ltd. All rights reserved.