共同研究・競争的資金等の研究課題

妊婦における薬物治療を有効かつ安全に行うためには、定常状態ヒト胎児/母体血漿中薬物濃度比（F/M比）は必須だが、情報に乏しい。本研究では、出産後のヒト胎盤のex vivo灌流に、生理学的薬物動態モデルを用いたin silicoでのパラメータ推定を組み合わせ、従来のex vivoヒト胎盤灌流のみでは実測できなかった低膜透過性薬物のF/M比推定手法（ex vivo-PBPKハイブリッド解析）を確立することを目指す。本研究は、多くの薬物のヒトF/M比が不明な現状を改善し、妊婦と胎児でのアンメットメディカルニーズに応える意義を有している。

胎児血中薬物濃度は妊婦への薬物治療において重要な指標であるが、ヒトで実測可能な薬物は限られる。本研究では、ヒト胎盤灌流およびラットでの薬物の胎児移行性評価から、ヒト胎児移行性を定量的に予測することを目指している。具体的には、定常状態での遊離形薬物濃度比を基準とし、実験手法の差や輸送体の種差を克服可能な胎盤透過の薬物動態モデルを構築することを目指す。

妊婦への薬物治療を妨げる一因は、妊娠進行に伴う薬物動態変動の評価が難しい点である。本課題を克服するには、妊娠に伴う薬物動態変動を規定する機構を解明し、その変化をモニター可能な技術を確立することが必要である。本研究では、薬物代謝酵素やトランスポーター発現に及ぼす胎盤エクソソーム中miRNAの影響を分子機構として解明し、胎盤による妊婦薬物動態の統合調節機構を明らかにすることを目指す。

胎盤関門においてトリプトファン(Trp)輸送を担う可能性が高いLAT輸送体のタンパク発現分子数を定量した結果、ヒトおよびラット胎盤関門において、LAT1およびLAT2タンパクの発現分子数定量に成功した。ヒトではLAT1およびLAT2の発現分子数が共に高かったのに対し、ラットにおいてはLAT1の発現量がLAT2に比べて数倍高いことが示された。げっ歯類胎盤における免疫染色においても、LAT1は胎盤関門の母体側細胞膜において高く発現していたのに対し、LAT2の発現は明確には示されなかった。さらに、LAT1が同様に高く発現している血液脳関門においては、血中アミノ酸濃度の変動がLAT1を介した脳への輸送速度を制御していることを、実験的に明らかにした。これらの結果は、LAT基質アミノ酸の総量に対するTrp存在比率(%)で定義されるTrpインデックスが、胎児など組織関門で制御されている領域へのTrp供給量、そしてキヌレインおよびセロトニン濃度を規定するとの仮説をサポートする成果として、重要である。 日本食品標準成分表に基づきTrpインデックスを算出したところ、食品の種類によってTrpインデックスは5倍以上異なっていた。得られたTrpインデックスに基づくと、Trp欠乏を補う食品としては通常、タンパク質に富み、Trpのアミノ酸スコアが100%を満たす魚・肉・大豆などが同列に推奨されるが、Trpインデックスがより低い魚類や肉類と比較して、高い大豆が望ましいといったより適切な指導が可能となる。 初年度の目標として最も重要な、Trp胎児移行に関わる主要輸送体のタンパク発現分子数の定量に成功した。その結果、LATの中でも特にLAT1が重要な役割を果たしていることをタンパクレベルで見出すことができ、申請者が提唱するTrpインデックスの有用性を裏付けることができた。そのため、進捗状況としてはおおむね順調であると判断している。ただし、ヒト胎盤においてはLAT1だけでなくLAT2も重要な役割を果たしている可能性が高いことが示された。LAT2の発現が血中アミノ酸濃度とTrp胎児移行との関係にどのような影響をもたらすのか、2019年度にモデル細胞を用いて解析を行う予定である。 胎盤関門細胞膜に高く発現することが示されたアミノ酸輸送体LAT1およびLAT2を発現する、ヒトおよびラット由来胎盤モデル細胞株をLAT選択的阻害剤共存下で培養し、LATを介したTrp の取り込み輸送が細胞内キヌレインおよびセロトニン産生量に与える影響を明らかにする。さらに、細胞をTrpインデックス2.5%の通常培地、Trpインデックス5%培地、あるいはアミノ酸強化培地（ただしTrpインデックス2.5%）で培養し、細胞へのTrp取り込み活性および、細胞内キヌレニンおよびセロトニン産生量の定量を行う。解析を通じて、細胞外Trp濃度ではなく、TrpインデックスがTrp細胞内取り込み量を規定しており、さらに、細胞内キヌレニンおよびセロトニン産生量を制御していることをin vitroで実験的に証明する。 Trpインデックスが高い食品および高たんぱく食品を模倣した食餌として、Trpインデックスの高い飼料あるいは、Trpインデックスは変わらないがTrp含有量は増加させた飼料を調製する。これら飼料を妊娠マウスの食餌とし、食餌変更後の母体・胎児血漿中アミノ酸濃度の変動をHPLCを用いて解析する。血漿中アミノ酸濃度を母体と胎児で比較することで、Trpインデックスの変動が胎盤関門LATを介したTrp移行に与える影響を明らかにする。さらに、母体脳、胎盤、胎児脳を採取し、アミノ酸、キヌレニン、セロトニン濃度の評価を行うことで、Trpインデックスとの相関を解析する。以上の研究を実施することで、食事中のTrpインデックスが、胎児におけるキヌレニンおよびセロトニン動態にどの程度影響するのか、明らかにする。

血液胎盤関門は胎児への物質移行を制御することで胎児環境維持を担うため、その機能制御機構の解明は重要である。本研究では、(1)血液胎盤関門への分化、(2)妊娠糖尿病モデルラット、(3)妊娠期低栄養モデルラットにおける血液胎盤関門トランスポーターの発現制御をそれぞれ明らかにした。本研究成果は、血液胎盤関門が母体栄養環境や胎盤分化過程に対応して胎児環境維持に向けたトランスポーター等の発現制御を受けることを具体的に示す重要な知見である。

前年度において、温度感受性SV40T抗原遺伝子導入トランスジェニックラットから樹立した条件的不死化網膜および脳毛細血管内皮細胞株(TR-iBRB細胞およびTR-BBB細胞)をin vitroモデルとして用い、両細胞株の発現遺伝子をdifferential display法を用いて解析した。その結果、TR-BBB細胞と比較してTR-iBRB細胞に高発現する遺伝子を8遺伝子検出することができた。今年度は、TR-iBRB細胞高発現遺伝子の特性を詳細に解析することを目的とした。TR-iBRB細胞高発現遺伝子のうち、TR-BBB細胞との発現量の差が最も大きい遺伝子はマウスM-cadherinの3'末端非翻訳領域と高い相同性を示した。マウスおよびヒトM-cadherinの配列をもとにプライマーを設計し,ラットM-cadherinをクローニングした。ラットM-cadherinのアミノ酸配列はマウス,ヒトとそれぞれ97%および86%の相同性を示し、細胞外繰り返し構造および細胞外領域におけるCa^<2+>結合モチーフなどcadherinに特徴的な配列を有していることが推定された。リアルタイム定量PCRを用いた解析の結果、ラットM-cadherinのmRNA発現量比は,TR-iBRB細胞においてTR-BBB細胞の93倍であった。さらに、Western blot法を用いた解析の結果、タンパク質レベルでもM-cadherinがTR-iBRB細胞に高発現していることが示された。以上の結果から、内側血液網膜関門にはM-cadherinが高発現し、細胞接着において内側血液網膜関門は血液脳関門とは一部異なる機構を有している可能性が示された。

本研究は血液網膜関門(BRB)には多様な異物排出機構が存在し、薬物の網膜移行性や網膜内老廃物の除去に機能していることを証明することを目的とした。[^3H]estradiol 17-β glucuronide (E17βG)もしくは[^3H]dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS)と、bulk flowマーカーとして[^<14>C]D-mannitolを同時に硝子体内に投与し、microdialysisプローブを用いて投与化合物の硝子体内濃度推移を測定し、BRBを介した排出輸送を評価した。[^3H]E17βGおよび[^3H]DHEASの硝子体からの消失速度定数は[^<14>C]D-mannitolよりも約2倍高く、E17βGおよびDHEASはBRBを介して排出されていることが示唆された。[^3H]E17βGおよび[^3H]DHEASの消失は各々非標識E17βGとDHEASで自己阻害された。さらに、[^3H]E17βGおよび[^3H]DHEASの消失はsulfobromophthaleinおよびprobenecid存在下、およびorganic anion transporting polypeptide 2(oatp2)特異的な基質であるdigoxin存在下で有意に阻害された。磁気分離したラット網膜血管内皮細胞画分におけるmRNA発現量を解析した結果、oatp2および14の内側BRBにおける発現が示された。さらに、網膜血管内皮細胞画分を用いた解析および免疫組織化学解析の結果、内側BRBの網膜側膜にはorganic anion transporter (oat) 3の発現が示された。 以上の結果から、内側BRBにはoatp2、oatp14、およびoat3が発現し、さらに少なくともoatp2はBRBを介したE17βGおよびDHEAS排出輸送に関与していることを示唆することができた。

ヒト胎盤関門頂端膜におけるグルコース、乳酸、ヌクレオシド、アミノ酸などのトランスポータータンパク発現量を明らかにした。ラット胎盤における同様の解析から得たタンパク発現量と、実測した胎盤透過速度を比較したところ、トランスポーター基質の高い胎盤透過性は示されたものの、タンパク発現量からの精密な透過速度予測に課題が残った。げっ歯類胎盤におけるABCトランスポーター発現は、母体血に接する胎盤関門第一層ではなく、第二層の頂端膜であることを明らかにした。つまり、ラット胎盤透過速度の予測精度向上には、一層で構成されるヒト胎盤関門とは異なり、二層の細胞層をつなぐ細胞膜を介した透過速度も考慮する必要がある。

妊娠進行に伴って、胎盤関門において特にグルコーストランスポーター(GLUT1)やモノカルボン酸トランスポーター（MCT1）など、胎児への栄養供給を担うトランスポーターのタンパク発現量は大きく変化する一方で、MDR1やBCRPの変動は大きくないことが明らかとなり、胎盤関門の可塑的な変化をタンパク発現量として明確にすることができた。さらに、胎盤関門と胎児血液脳関門の両方を機能制御しうる胎盤由来miRNAを見出すことができた。本研究成果を基盤として、胎盤および胎児脳血管内皮細胞形成と協調的な機能制御に関わる臓器間ネットワークの解明につながることが期待できる。

メチル基供与体のトランスポーターを介した胎盤透過を解析した結果、メチオニンを輸送するLAT1はラット胎盤の刷子縁膜に高発現し、アミノ酸を胎児に供給する役割を果たすことが示された。LAT1で輸送されるメチオニンと比較し、メチルテトラヒドロ葉酸やベタインの胎盤透過性は低い。そのため、胎盤透過性の観点からはメチオニンによる胎児へのメチル基供給を重視すべきと考えられた。また、ベタインの胎盤透過機構については、種差に注意すべきである。胎盤に発現するABCG2について、プロモーター領域におけるメチル化レベルは低いことが示された。

網膜ペリサイトから分泌される因子が網膜毛細血管内皮細胞の増殖を制御しているという仮説から、網膜毛細血管内皮細胞株と網膜ペリサイト株の共培養解析を行った結果、網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液を網膜毛細血管内皮細胞株に添加すると内皮細胞増殖を著しく抑制することを見いだした。本研究は、網膜ペリサイト細胞株が分泌する網膜毛細血管内皮細胞増殖抑制因子を同定することを目的とした。網膜ペリサイト株培養後の培地の濃縮液からタンパクを回収し、分子量で分画し、網膜毛細血管内皮細胞株の増殖を抑制するフラクションから2次元電気泳動でタンパクを分離した。分離したタンパクをMALDI-TOFMSで分析し、タンパクを同定した。同定したタンパクはtoropomyosin (TM)と高い相同性を示した。Rat TM3を特異的に認識するプライマーを作製してRT-PCR法でオープンリーディングフレームのクローニングを行った。さらに、RT-PCR解析からラット網膜、網膜ペリサイト株に発現が示された。増幅された網膜毛細血管周皮細胞株のPCR産物をDNAシークエンサー解析した結果、rat TM3、rat TM6と異なる配列を示した。得られた遺伝子配列をpGEX-6P-1 vectorに導入し、大腸菌を用いて大量培養した。大腸菌からタンパクを精製し、リコンビナントタンパクを作製した。リコンビナントタンパクはMALDI-TOFMSによってタンパク質量を測定し、さらにprotein sequencerを用いてN末端アミノ酸配列の解析を行い、同定したタンパクであることを確認した。網膜毛細血管内皮細胞株の増殖に対し、同定したタンパクは1μM以上の添加で顕著な細胞増殖抑制効果を示した。以上の結果から、網膜ペリサイトはTMと高い相同性を示すタンパクを分泌していること、およびこのタンパクは網膜毛細血管内皮細胞の増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。

抗酸化物質であるvitamin C (ascorbic acid, AA)の網膜への供給機構解明は、網膜の酸化的ストレス保護、さらに網膜疾患の予防および治療において重要である。本研究は、酸化型vitamin C (dehydroascorbic acid, DHAA)の網膜移行性を血液網膜関門(BRB)に存在するヘキソース輸送担体であるGLUT1が担っていることを証明すること、GLUT1におけるDHAAの輸送機構を解明すること、さらに糖尿病状態におけるDHAAの網膜への輸送能の変動について解明することを目的とした。BRB輸送解析は^<14>CでラベルしたAAおよびDHAAを用いて解析した。Integration plot法を用いた血液から網膜への移行性解析から、[^<14>C]DHAAは[^<14>C]AAと比較して38倍高いBRBを介した透過クリアランス値を示した。高速液体クロマトグラフィー解析から、網膜に取り込まれたDHAAは主にAAに変換されて存在することが示唆された。内側血液網膜関門のin vitroモデルとして用いたTR-iBRB細胞における輸送機能解析から、TR-iBRB細胞における[^<14>C]DHAA取り込みはNa^+非依存性、濃度依存性(Km=93μM)を示した。さらに、[^<14>C]DHAA取り込みは促進輸送型ヘキソース輸送担体(GLUT)の基質であるD-glucose、3-0-methyl-D-glucoseおよび2-deoxyglucoseや阻害剤であるphloretinおよびcytochalasin Bによって強く阻害された。D-Glucoseによる[^<14>C]DHAAの取り込み阻害定数(IC_<50>)は5.6mMであった。磁気ビーズ抗体を応用した網膜毛細血管内皮細胞高純度単離法を開発し、網膜毛細血管内皮細胞における発現遺伝子の定量を可能とした。Ex vivoラット網膜毛細血管内皮細胞には、GLUT family中でGLUT1が高く発現し、DHAAの網膜への輸送には主な役割を担っていることが明らかとなった。Streptozotoc-inを投与して作製した糖尿病モデルラットにおける[^<14>C]DHAAの網膜への透過クリアランスは、血中D-glucoseの上昇に伴い、コントロールに比べて31%低下した。以上の結果から、網膜へのvitamin Cの供給はBRBに発現しているGLUT1を介してDHAAとして輸送されることが明らかとなった。さらに、糖尿病時にはGLUT1の基質であるD-glucose濃度が上昇することから、網膜へのDHAA輸送能が低下し、網膜内へのvitamin C供給が減少する可能性が示された。

胎盤は母体および胎児間の物質輸送を担う臓器であるが、母体における循環血中の成分変動の影響を緩和し、安定的に機能する作用をもつ。胎盤において、胎児が必要とするアミノ酸の一部はシステムAと呼ばれるアミノ酸輸送機構を介して母体から胎児に供給される。本研究では、このアミノ酸輸送システムAの一部の分子は、母体循環血成分の変動に対し速やかに反応し、特に高い浸透圧ストレス負荷時には他の機能分子に先駆けて発現が増加すること、およびその発現変動機構の一部を明らかにした。

ヒト胎盤関門側底膜には organic anion transporter (OAT) 4 を介してエストリオール(E3)前駆体 16α-hydroxy dehydroepiandrosterone sulfate を胎児から取り込む機構が存在し、本機構は妊娠期 E3 合成量の決定因子の一つであることが示唆された。さらに、OAT4 の発現には、関門への分化過程における PKA シグナルを介した発現誘導機構が関与することを示唆する知見を得た。以上の結果から、胎盤内分泌機能においてトランスポーターによる胎盤透過性制御が重要な役割を果たすことが明らかとなった。

血液.組織関門の形成には組織特異的な関門細胞と血管内皮細胞(EPC)の相互作用がある。その解析のために、組織特異的関門形成細胞株を用いた評価系が望まれる。骨髄由来血管内皮前駆細胞株、TR-BME、を用いた研究で、タキサン系抗癌剤は殺細胞効果を示す濃度よりも低濃度で、EPCの遊走能阻害を主因とした血管発生を阻害し、腫瘍増殖抑制効果を示すことが明らかとなった。