共同研究・競争的資金等の研究課題

生命の発生は多数の細胞分裂により成り立ち、その現象の理解には細胞分裂の過程を記述できる細胞系譜の作成が有用である。本研究の目的は、時系列で取得される顕微鏡画像から物体(細胞)を間違いなく捕らえ、追い続けることで自動的かつ正確な細胞系譜を構築するアルゴリズムを開発することである。これにより、定量生物学やシステム生物学に代表される画像解析を活用した生命科学研究の効率化への貢献を目指す。 令和2年度は山縣研究室から提供いただいたマウス胚4次元蛍光顕微鏡画像を用いて畳み込みニューラルネットワーク(CNN)の構造、学習アルゴリズムの適否について詳細に検討を行った。研究協力者である東京大学小林徹也博士が構築した整数計画法によるトラッキングアルゴリズムを提供いただき、この整数計画法によるトラッキングアルゴリズムを基盤に深層学習による拡張を行う手法を検討した。提供いただいた整数計画法によるトラッキングアルゴリズムはトラッキングのコストを最小化する最適化問題を解くアルゴリズムとして構成され、コストは時系列画像のフレーム間毎の各細胞同士の重心間距離が採用されている。コストの和が最小となる対応関係が時刻間の細胞の接続関係として推定されるため、本年度では上記アルゴリズムを拡張し、細胞間距離のみをコストとして採用するのではなく、他の指標を含めた最適なコスト関数を導出する学習器の設計を行った。具体的には、細胞核の形状から特徴を抽出し、コスト関数に組み込む手法を提案した。当研究室により開発された細胞同定アルゴリズムであるQCANet は世界最高精度で細胞核の形状を同定(セグメンテーション)することが可能である。次年度以降の実装方針として、QCANet により取得された細胞の形状を学習器の入力に与える手法を採用することが決定した。 研究開始初年度であるため学術論文はまだ出ていないが、招待講演3回、基調講演1回、総説2報、ポスター発表1報にて本研究の進捗を報告した。 当初の今年度の予定ではマウス胚4次元蛍光顕微鏡画像の解析及びニューラルネットワークの構造と特徴抽出についての詳細な検討、既存の画像処理アルゴリズムを採用しているトラッキングアルゴリズムとの比較を主眼としていた。実際には調査のみにとどまらず、機械学習アルゴリズムの試験的実装まで到達した。また、現状では予備評価でしかないが、既存のアルゴリズムとのトラッキング精度の比較まで進めることが出来た。今年度の成果は次年度以降の開発方針を決定する上で重要な情報であり、十分な成果を得られたと考えられる。 今後は畳み込みニューラルネットワークを用いて物体の特徴を抽出し、形態的特徴を活用したトラッキングアルゴリズムの開発に注力する。既に深層学習を用いた細胞同定アルゴリズムであるQCANetの実装は完了している。QCANetは世界最高精度で細胞核を同定(セグメンテーション)することが可能であり、QCANetで得られた細胞核の特徴を活用し、トラッキングアルゴリズムに活用することを計画している。

生命科学の研究領域において、イメージング技術は分子・細胞から個体に至るまで広く汎用されており、その必要性は益々増加している。 本支援では、生理学研究所と基礎生物学研究所を中核機関として、各種の先端・特殊イメージング機器を運用している共共拠点や大学・研究機関イメージング関連施設が連携するネットワークに個別支援項目を加えたプラットフォームを組織し、光学顕微鏡技術、電子顕微鏡技術、磁気共鳴画像技術、及び画像解析技術支援を行う。加えて、国際的バイオイメージングコンソーシアム（Global　BioImaging）との連携により、日本におけるバイオイメージング技術の高度化と支援体制の充実を図る。

本研究は、ネムリユスリカの乾燥・再水和の過程で生じる”DNAの障害”が、”どの場所”で生じて、”どのような因子で保護・修復”しているのかを知ることで、"乾燥耐性をもたらすDNA修復機構"の全容を解明することを目的とする。新規DNA保護・修復因子を利用することで、乾燥などのストレスに強い作物の育種や細胞を作出することが可能となる。DNA修飾活性因子を使えば、新たなゲノム編集技術への応用も期待できる。

本研究は筋組織のin vitro 3次元組織形成において「人の介在と思い込み」を排除し，生命科学実験を自動的・自律的に実行可能とする「知能化培養システム」を構築する．この培養システムは，3次元組織培養・力学刺激・蛍光観察が可能な培養モジュールを複数並列して順次的に培養することで，「観察」「計画」「行動」「発見」という科学者の研究サイクルをアルゴリズムとシステムインテグレーション技術により自律的に行い，生命科学の重要な課題である組織成熟化と力学刺激の関連性の解明を目指す．さらに本技術をヒトiPS由来心筋組織に適用することで高度に成熟化したin vitro心筋組織を構築し，医療応用展開を探索する．

本研究の目的は，多様な力学刺激条件によって促進されるin vitro 3次元組織の成熟化の条件探索プロセスを，計算機制御された力学刺激培養装置と単一細胞ライブイメージングおよび深層学習，ベイズ的最適化を併用することで，迅速かつ効率的・効果的なin vitro組織成熟化を可能とする新規方法論を創出することである．これにより，金銭的・時間的・人的に多大なコストが必要であった現在の再生医療研究開発の課題を革新的に解決すると同時に，汎用的な組織工学の次世代基盤技術の創出を目指す．

平成29年度は山縣研究室から提供いただいたマウス胚3次元蛍光顕微鏡画像から核のみをセグメンテーションするアルゴリズムの実装を行った。前年度の実装結果を反映し、セグメンテーションアルゴリズムには多層のニューラルネットワークから構成される深層学習を用いた。学習に用いるデータセット作成においては、マウス胚4次元蛍光顕微鏡画像から4細胞期のある 1 time point のみを切り出し、それに伴う正解データ(セグメンテーション画像)を手動で作成した。また、取得された3次元蛍光顕微鏡画像はZ軸方向の解像度がXY軸方向の解像度と比較して粗いため、蛍光顕微鏡画像を単純に3次元再構成を行った際には実際の胚と異なる形状となってしまう問題があった。そこでXY軸、Z軸の解像度を合わせるために顕微鏡画像および正解データに対してZ軸方向の補間を行った。学習器の実装においては、深層学習アルゴリズムとして Convolutional Neural Network をベースに3次元セグメンテーションアルゴリズムを実装した。 実装した3次元セグメンテーションアルゴリズムのセグメンテーション精度を評価するため、異なる time point における細胞期(4, 7, 8, 9, 13, 14)の画像を用いて検証を行った。評価に用いた画像は学習データに含まれていないため、同アルゴリズムが汎化性の高い学習が行われているか(一般的な核の形状的特徴を学習できているか)を確認することが出来る。当該年度に実装したアルゴリズムは4細胞期のデータのみ学習させた学習器にもかかわらず、異なる細胞器を含めたセグメンテーションにて平均精度 98.74% (voxel accuracy) を達成した。 今年度は深層学習を用いた核同定アルゴリズムの開発を行った。核同定の精度は voxel accuracy にて 98.74% を達成し、当初の想定以上の成果を達成できた。一方、発生が進み核が密集しているような状態(50細胞期等)では個々の voxel が核か否かを判別することには成功しているが、同定された隣り合う核が融合してしまい、個々の核を判別することが困難であることが明らかとなった。次年度の計画として、密集した核の分離が可能となるようなアルゴリズムを開発する必要がある。今年度の成果は次年度以降の開発方針を決定する上で重要な情報であり、十分な成果を得られたと考えられる。 今後は実装した学習器の精度向上を目指し、異なる細胞期画像の学習や、ハイパーパラメータのチューニングを行う。また、セグメンテーション評価を voxel-wise で行っていることから、一般的にセグメンテーション評価に用いられているrand error や warping error による評価を行うことを計画している。 また、核同定アルゴリズム自体の改良として、50細胞期など核が密集した状態でも正確に個々の核を同定可能となるアルゴリズムの開発を行うことを計画している。

本研究は既存の画像解析・機械学習アルゴリズムでは実現されていない、細胞種に依らない汎化性が高い高精度細胞セグメンテーションアルゴリズムの構築をAutoencoder(自己符号化器)を用いることで実現することを目的としている。 平成30年度は多層ニューラルネットワークの構造、学習アルゴリズムの適否について詳細に検討し、検討を行ったアルゴリズムから順次実装を進めた。当研究課題において開発を行うセグメンテーションアルゴリズムの中核をなすのは多層ニューラルネットワークと自己符号化器となる。当該年度では多層ニューラルネットワークの一種であるU-Netをベースとしたアルゴリズムの検討を行った。 U-Netは大局的な特徴を抽象化して学習するとともに、局所的な特徴も合わせて学習することが可能なアーキテクチャであり、その独自なネットワーク構造により高い性能を示すが、機械学習が本質的に持っている問題点である「学習効果は与える学習データに強く依存する」という点は未解決である。当該年度はU-Netの構造を保ちつつ、自己符号化が可能なネットワークの検討を行い、Pythonによる深層学習フレームワークである Chainer を用いて実装を行った。 学習データに関しては、HeLa細胞の顕微鏡画像を撮像しセグメンテーションの正解データを用意し、セグメンテーションの学習を行った。また他の細胞種(NIH3T3, SH-SY5Y等)の顕微鏡画像を撮像し、自己符号化器にて教師なし学習を行い、精度評価を行った。 畳み込みニューラルネットワークを用いた細胞セグメンテーションアルゴリズムである U-Net と自己符号化器を結合した学習モデルの構築を行った。モデル前半部は自己符号化器として正解ラベルを用いずに NIH-3T3 細胞画像を学習させ、モデル後半部は NIH-3T3 の自己符号化器で得られた特徴を基に HeLa 細胞画像の正解ラベルを用いて学習を行った。 得られた三つの学習済みモデルで NIH-3T3 のセグメンテーションを行い精度を評価した。 セグメンテーションの評価指標であるIoUを用いてセグメンテーション精度を評価した。HeLa を学習させた U-Net モデルの IoU が 0.609 であったのに対し、本研究のモデルは 0.496 であり、先行研究を上回らなかった。 本研究のモデルが高精度にセグメンテーションを行えなかった理由を明らかにするべく、学習済みモデルの解析を行ったところ、モデル前半部の自己符号化器の学習が適切に行われなかったことが明らかとなった。 本研究で提案したアルゴリズムは、先行研究のU-NetモデルにHeLaを学習させ、NIH-3T3をセグメンテーションした場合の精度を上回らなかった。今年度は、自己符号化器モデルの構造の再検討や入力画像へのノイズ付加によって、自己符号化器がセグメンテーションに有効な特徴を抽出するような改良を計画している。 具体的には、まずNIH/3T3の顕微鏡画像で自己符号化器モデルを学習させ、NIH/3T3の特徴を抽出した後、自己符号化器で抽出した特徴を各層ごとに連結したモデルを作成することを計画している。続いて、作成したモデル内の自己符号化器で抽出した特徴を利用しつつHeLaの正解ラベルを用いて学習させることで自己符号化器で抽出した特徴を利用して細胞画像をセグメンテーション可能なモデルの構築を計画している。

申請者は心筋細胞の純化法や大量培養法を確立したが、多能性幹細胞由来の心筋細胞技術の汎用化、産業化のためには大量の心筋細胞の品質を効率よく短時間で評価する方法を確立する必要性がある。画像解析データとオミックスデータを照合することによって心筋細胞の分化誘導効率と成熟度を評価するアルゴリズムを作製することができれば、心筋細胞の品質評価だけでなく、効率的な心筋細胞の分化誘導法や成熟化法を開発するための強力なツールとなる。 本挑戦的技術の開発は病態解明と創薬開発におけるES/iPS細胞研究のブレークスルーを達成するものであり、その成果は循環器領域にとどまらず他領域にも役立つ極めて汎用性の高い技術である。

昨年度に続き、流路抵抗生成部を備えたマイクロ流体デバイスを用い、3つのチャネルごとに異なる流量下で培養を行い、流れのSH-SY5Yの神経突起慎重方向の分布への寄与を検討した。SH-SY5Yはレチノイン酸及び脳由来神経栄養因子を用いて分化誘導を行った。準備したSH-SY5Y細胞を培養デバイスに撒種し、静置培養の場合をコントロールとして、流路ごとに神経突起の伸長方向を計数した。取得したデータに対しベイズ統計解析を行うにあたり、神経突起方向の角度分布を説明する仮説として、灌流培養時に神経突起方向がランダムに分布するのか、または流れの方向に偏るのか、静置培養時と比較した場合灌流培養時は流れの方向に神経突起方向が偏るのか、またはその逆かを検討した。解析の結果、もっとも流量の小さい流路(0.017[マイクロリットル/分])においては、流れの方向に神経突起の伸長方向が偏る仮説は支持されなかったが、これより10倍、または100倍の流量のチャネル内では、静置培養と比較した場合灌流培養時は流れの方向に神経突起の方向が偏るという仮説が強く支持される結果となった。 昨年度までの成果として、流れがある場合、流量が増えるにつれ分化が誘導されやすい傾向が観察されている。今年度の成果と考え合せた場合、灌流培養下のSH-SY5Yは、分化が亢進さ、伸長した神経突起は流れに沿う形で伸びる傾向にあることが示唆された。 今後、一つの細胞型の細胞とインタラクションを形成する場合に、慎重突起の方向が流れと同じ方向なのか、または逆らう向きなのかなどを同定することで、流れを利用した神経細胞ネットワークの制御を実行する系の構築を目指す。この目的にあたり、神経細胞内の構造を観察できるマーカータンパク質の染色などを行い、視神経突起伸長が流れの軸にそうかどうかだけでなく、前後の方向も突き止めていく。 現在までに流量の異なる灌流培養環境内で、分化の特徴が観察されるのに十分な時間細胞を培養、観察、撮像することに成功しており、必要な解析のためのデータを収集することに成功している。 また、分化の促進、神経突起慎重方向の偏りなど、流れを利用した神経細胞ネットワーク制御に向けて活用方法を計画できる結果が得られており、今後の計画実行に着実に結びついている。 神経細胞としてのシグナルの伝達の方向まで制御できるようにするためには、神経突起が形態的に流れに沿う方向に分布しているかどうかだけでは情報が十分ではない。 そこでまず第一に、様々な流量の流れを与えられる培養環境で、細胞-細胞間のインタラクションが観察できる培養方法を構築する。この目的で、事前の分化誘導方法、長時間の灌流培養の実現に必要なデバイス構造の検討を行う。また、デバイス内で増殖しながら分化する過程への流れを含む環境の影響を解析し、分化細胞が生じる方向の制御を行うことも視野に含める。 また、神経突起がどの細胞から、どの細胞に向かって伸び、インタラクションしているかを同定できるように、神経細胞内に発現が確認されている各種マーカーの染色、ライブイメージング系の構築などに着手する。 以上の検討を進め、流れを利用することで神経細胞ネットワークを予定した方向に構築することができるか検証する。

本研究の目的は動物細胞の細胞分裂を再現する力学モデルを構築し、そのモデルの妥当性を実験的に検証することである。実験には線虫C. elegansの初期胚を主に用いる。研究代表者はこれまでに、動物細胞の細胞分裂に伴う空間的に動的な過程である(i)細胞質流動、(ii)細胞核の中央配置、(iii)染色体の分配（紡錘体の伸長）、および(iv)細胞質分裂、に関してそれぞれ力学モデルを提案してきた。本研究では、これらの力学モデルを発展させるとともに、異なる過程を統合する統一的なモデルの構築を目指して研究を進めている。力学モデルの構築は、研究分担者である舟橋啓博士（慶應義塾大学）とともに進めた。 （１）新たなタイプの細胞質流動のモデル化：新たなタイプの細胞質流動として、流動方向があらかじめ決まっておらず自己組織的に形成・変化する流動の解析を行い、力学モデルの構築に成功した(Kimura K. et al., Nat Cell Biol, 2017)。 （２）細胞分裂に伴う細胞配置のモデル化：細胞分裂に伴って形成される２つの姉妹細胞はお互い、あるいは周囲の細胞と力を及ぼしながらその配置を決める。その配置機構について実験観察から新たな力学モデルを構築した(Yamamoto & Kimura A., Development 2017)。 （３）「核の中央配置」と「紡錘体の伸長」に関わる微小管の力学モデルの統一化：この両者のプロセスは共に微小管によって駆動されるが、同じ枠組みのモデルで説明できるかどうかについて解析を進めたところ、微小管の角度に関する条件を変えることで統一的に説明可能であることが示唆された。 （４）「細胞質流動」と「核の配置」を統合するモデルの構築：細胞質（流体）と核（剛体）の動きの関連を検討するためのモデルの枠組みを構築した。 研究対象として設定していた(i)細胞質流動、(ii)細胞核の中央配置、(iii)染色体の分配（紡錘体の伸長）、および(iv)細胞質分裂、について新たなモデルを実験結果に基づいて提案するとともに、統合化も進んでいることから順調に進展していると判断した。研究の結果、力学モデルから新たな示唆が得られ、その実験的検証のために、研究期間を延長し、追求することにした。 力学モデルから得られた示唆を、細胞の変形実験を活用して検証する。細胞の変形の方法については、報告者が確立した方法(Yamamoto & Kimura A. 2017)を用いる。数理モデルと実験の比較からモデルの妥当性を検証し、結果を論文発表する。

神経細胞内マグネシウム（Mg）イオン動態をイメージングにより網羅的かつ定量的に調べ、細胞内情報伝達物質としてのMgイオンの新規な役割を明らかにした。培養初期の神経細胞について研究を進めたところ、抑制性神経伝達物質であるGABAの神経回路成熟への関与を明らかにできた。このGABAの効果は細胞内Mgイオンの動員を介していた。特にこれまで明らかにされていなかったMgイオンのシグナル伝達下流で、細胞内シグナル分子であるERKの活性を抑制、CREBの活性を促進、mTORの活性を促進した。特にmTORシグナルに関しては、Mgイオンは活性のオン・オフを切り替えるスイッチの役割を担っていることを示した。 Mgイオンはその重要性については広く理解されていたものの、具体的な役割については未知の点が多かった。今回の研究では、Mgイオンの細胞内動員は同じ２価の陽イオンであるCaとは大きく異なることを明らかにするとともに、これまで不明であったMgイオン下流の情報伝達過程について明らかにすることに成功した。特に主要なシグナル経路であるERK、CREB、mTORのリン酸化過程をMg動員が異なる仕方で制御していることを明らかにした。これらの結果はMgイオンの生理的な役割の理解を深めるとともに、様々な細胞レベルでの疾患や病態を理解する一助になるものと期待される。

黄川田グループ：平成29年度は、ネムリユスリカ培養細胞の乾燥耐性誘導過程に変動するゲノム高次構造を知る目的で、手始めに水和状態のPv11細胞をコントロールにin situ HiC解析を行った。その結果、染色体のTADとドメイン構造を判別することが可能になった。また、HiCデータの利用により、ネムリユスリカゲノムアッセンブリーのスキャホールドN50の大幅な向上が確認できた。Pv11細胞の乾燥・再水和過程の遺伝子発現変動パターンを知るために、total RNA-seqを実施した。得られたデータを舟橋グループに供与した。CRISPRによるゲノムワイドな遺伝子破壊を実行するために、ネムリユスリカゲノム上のPAM配列を含む領域を網羅的に同定し、最終的に100,000個のサイトを選抜した。また、CRISPRによってターゲット遺伝子に変異が生じた細胞を効率良く単離するためのソーティング技術も確立することができた。 舟橋グループ：平成29年度は、細胞単位で乾燥耐性を持つことが報告されているネムリユスリカ胚由来培養細胞であるPv11細胞の乾燥耐性獲得に必要とされるトレハロースを豊富に含む培地で処理するトレハロース処理後の時系列RNA-seqデータをもとに、発現を有意に変動させた転写因子を統計解析により得た。続いて、これら転写因子の発現変動の前後関係をもとにダイナミックベイジアンネットワークモデル及び確率微分方程式モデルを用いて各転写因子間の制御関係を推定した。 黄川田グループ：in situ Hi-C技術が、非モデル生物の培養細胞であるPv11にも適用可能である事を確認できた。その上、ゲノムアッセンブリーの向上が行えた結果、染色体数（4組）とほぼ同数のスキャホールドを得るに至った。この精度の高いゲノム情報は、今後のトランスクリプトーム解析の確度を高める事が大いに期待できる。Pv11細胞でのCRISPR技術も確立できたことで、乾燥耐性に寄与しうる遺伝子を効率良く同定する方法論が出そろった。 舟橋グループ：今年度はPv11細胞の時系列RNA-seqデータを用いて乾燥耐性獲得に関わる転写制御ネットワークの推定に成功した。推定されたネットワークの尤もらしさ(生物学的妥当性)を評価するために、推定したネットワークの次数分布と冪乗則を仮定した際の指数の評価を行った。推定したネットワークは既知生物種の転写制御ネットワークと類似した次数分布、冪乗則の指数を示したことから、生物学的に尤もらしい乾燥耐性転写制御ネットワークが得られている可能性が高いと考えられる。 黄川田グループ：今年度確立された技術を大きく展開し、乾燥誘導過程のTADの変動とそこに含まれる遺伝子セットの発現変動の相関を順次解き明かしていく。Pv11細胞へのCRISPRもハイスループットかを推し進めることで、ゲノムワイドな乾燥耐性責任遺伝子の同定を効率良く進めていく。 舟橋グループ：今年度推定を行ったネットワークの構造に基づき、上流遺伝子のノックアウト・ノックダウン実験を行い、下流遺伝子の発現が有意に変動するかを検証することを計画している。これにより、ネットワーク中の偽陽性(本来は制御関係がない場所にあるとしてしまう過誤)の排除を行うことができる。平成29年度では乾燥耐性獲得に関わる転写制御ネットワークの推定を行ったが、今後は再水和過程における転写制御ネットワークの推定、更にはゲノム構造変化にともなう乾燥無代謝休眠特異的な遺伝子制御ネットワークの推定を行う。