共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究では、申請者らが最近発見したヒトSyncytin1由来の膜透過促進ペプチドと、独自のmRNAディスプレイ法による小型ドメイン抗体や人工ペプチドリガンドの試験管内選択技術を利用して、これまでバイオ医薬の創薬ターゲットにできなかった細胞内の疾患標的を対象とする画期的な抗がん剤の開発のための要素技術を確立することを目的とする。従来の抗体医薬による細胞外のターゲットだけではなく、「細胞内に広がっている未開の領域」を新たに創薬ターゲットとすることが可能になれば、我が国のバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に多いに貢献することが期待できる。 本研究計画では、これまで創薬ターゲットとすることが困難であったがん細胞内の疾患標的に結合するバイオ医薬を、がん細胞選択的に細胞内に送達させることで、２重の鍵をもつきわめて副作用の少ないがん細胞選択的膜透過バイオ医薬を開発することを目的としている。細胞内の疾患標的に対するバイオ医薬として、mRNAディスプレイ法により当研究室で作製済みのアンドロゲン受容体（AR）スプライスバリアント7 (AR-V7) に対する小型ドメイン抗体を用いるが、抗体医薬だけではなくペプチド医薬や核酸医薬についても並行して検討することでリスクヘッジすることを計画している。 まず、核酸医薬として、AR-V7に対するsiRNAとAgo2タンパク質とのRNA-タンパク質複合体を細胞質に効率よく送達させるために、独自のヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを融合したAgo2タンパク質を昆虫細胞で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加した結果、ARおよびAR-V7遺伝子の共通部分配列に対するsiRNAを用いた場合に、標的遺伝子が従来法よりも効率よくノックダウンされることをRT-qPCRにより確認できた（論文投稿中）。 また、ペプチド医薬のモデルとして、アポトーシス誘導ペプチドを細胞選択的に細胞質に送達させるために、膜透過促進ペプチドをLDL受容体結合ペプチドとともにアポトーシス誘導ペプチドに融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、ヒト培養細胞に添加したところ、LDL受容体発現細胞選択的な細胞生存率の減少とアポトーシス誘導によるカスパーゼの切断を確認できた（学会発表済み、論文投稿中）。 さらに、AR-V7に対する抗体医薬をがん細胞選択的に細胞内デリバリーするために、初年度は、様々ながん細胞で高発現しているEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択した。 コロナ禍で前半は実験ができない期間があったこともあり、今年度から新たに始めたEGFRを認識する人工ペプチドリガンドおよび小型抗体のmRNAディスプレイ法による試験管内選択については年度内に終えることができなかったが、これまでに利用していたLDL受容体結合ペプチドを利用した細胞選択的DDSについては論文投稿に必要なデータを揃えることができた。また、抗体医薬の細胞質送達については次年度に継続して検討を進めるが、核酸医薬とペプチド医薬についてはモデル系で細胞質送達を確認することができたことから、全体としてはおおむね順調に進展していると判断した。 前年度に引き続き、がん細胞表面マーカーとして、様々ながん細胞で高発現しているEGFRやHER2を認識するpH応答性の人工ペプチドリガンドまたは小型ドメイン抗体をmRNAディスプレイ法により試験管内選択する。創出したEGFR／HER2結合ペプチドリガンド／抗体、および、ヒトSyncytin1由来膜透過促進ペプチドを核移行配列とともにAR-V7に対する小型ドメイン抗体に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製する。これを前立腺がん由来LNCaP細胞または22Rv1細胞の培地に添加したとき、細胞質および核内に取り込まれ、ARおよびAR-V7の転写活性を阻害することを、AR転写調節領域の下流にルシフェラーゼ遺伝子を挿入したレポータージーンアッセイにより確認する。さらに、制がん活性評価のために、22Rv1細胞またはLNCaP細胞にジヒドロテストステロンを添加したときに誘導されるPSAの発現をRT-qPCRで評価する。 また、独自のヒトSyncytin1由来ペプチドの膜透過促進活性の向上に資するために変異解析を行い、機能に重要なアミノ酸を特定する。具体的には、部位特異的変異を導入した膜透過促進ペプチドを、上記受容体結合ペプチドリガンド／抗体とともに蛍光タンパク質に融合したタンパク質を大腸菌で大量発現・精製し、受容体発現ヒト培養細胞に添加したときの細胞内取り込みの変化を共焦点蛍光顕微鏡で観察する。

NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本研究では肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立を行う。肝類洞内皮で高発現するSema6AはSema6A-PlxnA2シグナルを介して肝星細胞の活性化を抑制し抗線維化治療分子として有用な可能性が示唆される。Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明する。類洞という肝微小構造の解剖学的特徴を利用し、効果的なSema6Aの投与方法を確立する。さらには、PlxnA2をターゲットとした新たな代謝性肝疾患治療を確立する。

研究代表者らは、ヒト胃癌組織 で、アクチン重合制御蛋白質CAPZA1の過剰発現細胞が、CD44v9陽性癌幹細胞の前駆細胞となることを報告し、CAPZA1の機能制御がCD44v9陽性胃癌幹細胞の発生阻害に繋がることを示した。本研究は、CD44v9陽性癌幹細胞の発生を阻害する分子標的型CAPZA1高親和性ハイブリッドペプチド／抗体と、癌部で既に発生しているCD44v9 陽性癌幹細胞の選択的排除能を有する分子標的型複合ナノ微粒子を創出する。設計・開発された分子標的バイオ医薬は、ヒト胃癌オルガノイド由来mucosoidを用いて機能評価し、癌幹細胞標的療法として創薬応用する。 胃オルガノイド由来幹細胞駆動型上皮細胞モデルMucosoidを用いた解析では、酪酸刺激にて、胃上皮細胞のCAPZA1発現は顕著に亢進し、H. pylori感染により、CAPZA1過剰発現細胞依存的にCagAが蓄積していくことが、Westernblotting並びに共焦点レーザー顕微鏡解析による免疫染色法により明らかになった。また、mRNAディスプレイ技術を用いて、CAPZA1を分子標的した蛋白質相互作用阻害ペプチドの開発とスクリーニングを行い、CD44v9陽性細胞の発生制御技術の開発を行っている。CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができた。mRNAディスプレイ技術によるCAPZA1結合ペプチドのセレクション探索と並行して、まず野生型LRP1-ICDに膜透過促進ペプチドS19-TATとeGFPを融合したタンパク質を大腸菌で調製した。調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進した。また、CD44v9を特異的に標的するために、CD44v9陽性細胞に特異的な多糖ナノ粒子による遺伝子のデリバリーシステムの開発を行った。異なる組成の多糖ナノ粒子での検討を行うことで、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られた。この成果を基盤に、自殺遺伝子(pTK)含有多糖ナノ粒子を用いてCD44v9陽性細胞に対する抗腫瘍効果を検討している。 本研究では、CAPZA1過剰発現細胞、およびCD44v9陽性癌幹細胞を標的とした次世代分子標的バイオ医薬を開発し、「癌幹細胞/前駆細胞選択的二段階駆逐型新規癌治療戦略」の確立を目的としている。令和2年度の研究成果により、胃内共生細菌由来代謝物依存的なCAPZA1過剰発現を介したCD44v9陽性細胞の発生機構が胃オルガノイドを用いたモデルで明確化され、その細胞の標的技術として、mRNAディスプレイ法とキトサン/ヒアルロン酸(HA)で構成したナノ粒子への自殺遺伝子のパッケージング法の開発が順調に進んでいる。今後、これらの標的技術の精度の向上と、標的化の実践の確認のために、胃オルガノイドモデルを用いた機能評価が必要となるが、ここまでの研究開発により標的技術の開発はおおむね順調に進んでいる。 令和2年度の成果により、mRNAディスプレイ法を用いたCAPZA1過剰発現細胞の標的技術開発では、CAPZA1にビーズ固定用のSBPタグを融合したCAPZA1-SBP蛋白質を大腸菌で大量発現・精製し、AGS細胞抽出液に含まれるLRP1-ICDとの結合を確認することができたので、今後、CAPZA1-SBPをベイトとしたmRNAディスプレイ法を用いて、CAPZA1に結合するペプチドまたは小型抗体のセレクションを行う。また、調製されたeGFP-LRP1(ICD)-S19-TAT融合蛋白質をAGS細胞に添加すると、膜透過促進ペプチドS19の機能によりLRP1-ICDの細胞内移行が促進したが、過剰なLRP1-ICDの細胞内移行により細胞死が誘導され、LRP1-ICDの細胞内移行量の調節技術が必要になることが示唆されたため、CAPZA1過剰発現細胞特異的にLRP1-ICDを送達させることを目的に、CAPZA1過剰発現特異的な細胞表層受容体の探索・同定をAGS培養細胞とMucosoidモデルを用いて実施する予定である。さらに、ルシフェラーゼ遺伝子(pLuc)／キトサン／ヒアルロン酸の三元複合体糖ナノ粒子では、CD44v9陽性細胞に特異的な遺伝子の細胞内導入、微小管依存的な核への輸送、および顕著な遺伝子発現活性が得られたため、今後、この糖ナノ粒子内へ自殺遺伝子(pTK)をパッケージングし、CD44v9陽性細胞特異的な抗腫瘍効果をMucosoidモデルにて検討する。

本研究では、申請者らが発見したヒト由来の膜透過促進ペプチドを利用したタンパク質・核酸の細胞質送達技術と、独自のmRNAディスプレイ法による小型抗体の試験管内選択技術を利用して、感染症の標的となる細胞内の因子に対するバイオ医薬の創出・送達手法を確立することを目的とする。これまで感染症に対するバイオ医薬の標的はウイルス・細菌の表面タンパク質や受容体など細胞外の分子に限られていたが、本研究を契機として、病原体の耐性獲得に左右されにくい細胞内の分子を標的とすることが可能になれば、我が国の感染症に対するバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大いに貢献することが期待できる。 （1）HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田） 肝細胞特異的に発現しているアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR)に結合する小型抗体やASGRのリガンドであるtri-GalNAcと、ヒトSyncytin1やIZUMO1由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したAgo2タンパク質をキャリアとして、siRNA医薬を肝細胞選択的に効率よく細胞質送達できる全く新しいDDSを開発するために、蛍光タンパク質をモデルとして共焦点顕微鏡観察することで、コンストラクトの最適化を進めた。また、DOCK11以外の新たな標的を見い出すために、野生型とAAV8-HBV1.3mer慢性感染モデルマウスの肝組織を用いたシングルセルトランスクリプトーム解析を行い、HBV関連遺伝子と宿主側の遺伝子を区別して空間的な情報を得ることができた。 （2）クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川） Axlの細胞内ドメイン(ICD)の様々な部位に結合する多様な小型抗体を１次セレクションし、その中から、所望の経路のみを活性化する小型抗体の２次スクリーニングを行うために、１年目は、Axl(ICD)の部分断片にビーズ固定用のタグを融合した遺伝子の発現用プラスミドを構築し、大量発現・精製した。Axl(ICD)断片が非天然変性領域を含むため苦労したが、ビーズへの固定を確認することができた。また、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルの亢進がTight-junctionの増強と同時に腸管上皮細胞における細胞増殖も増強することをin vitro感染モデル試験にてki67染色を指標に明らかにした。このin vitroモデルを小型抗体の2次スクリーニングに利用することで、細胞増殖の誘導を引き起こさない医薬品の開発が可能になると考えられる。 ASGRに結合する小型抗体やASGRのリガンドである tri-GalNAc と、ヒト Syncytin1 や IZUMO1 由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したタンパク質の肝細胞選択的な取り込みを確認できたこと、また、Axl(ICD) の各部位に結合する多様な小型抗体のセレクションに必要となるAxl(ICD) の部分断片を調製できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。 (1) HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田） 前年度に引き続き、Ago2融合タンパク質とsiRNAの複合体をヒト培養細胞に添加し、肝細胞選択的に細胞内に送達されることを共焦点顕微鏡観察により確認することで、コンストラクトの最適化を進める。また、複合体が細胞質で標的mRNAを分解していることを確認するために、ヒト培養細胞の内在遺伝子やDOCK11に対するsiRNAとの複合体を肝細胞由来の培養細胞に送達し、培養細胞から抽出した標的遺伝子に対するmRNA量をRT-qPCRで定量する。さらに、前年度のHBV複製に関わる遺伝子情報の包括的解析から、核酸創薬に適した標的細胞から数種類の標的遺伝子まで絞り込み、先行したDOCK11の研究基盤データと比較して、新たな核酸創薬に最適な標的遺伝子を同定する。 (2) クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川） mRNAディスプレイ法により、すでに構築済みのヒト単一ドメイン抗体ライブラリーから、前年度に調製したAxl(ICD)に結合する小型抗体を試験管内選択する。その後、１次セレクションで得られた小型抗体を腸管上皮細胞由来 Caco-2細胞で発現させることでTight-junctionタンパク質の発現が変化するクローンを２次スクリーニングする。このときTight-junctionタンパク質のプロモーター細胞の構築と合わせて、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルを確認し、クレブシエラ感染症予防に最適な２次スクリーニング技術を確立し利用する。

H. pylori感染でのオートファジー発現はCagA分解を担い癌化を抑制するが、CD44v9発現癌幹細胞ではオートファジーが発現せず細胞内CagAが蓄積する。さらに、我々はCAPZA1が核内でLRP1-ICDと結合し LAMP1発現を阻害すること、CAPZA1過剰発現細胞にCagAが装填されるとCD44v9発現が亢進することも示した。CD44v9と核内移行CAPZA1を標的するため、ヒトSyncytin 1由来膜透過促進ペプチドS19とTAT を組み合わせ、細胞内異物分解から離脱させた。抗CD44v9一本鎖抗体/ヒト由来膜透過促進ペプチド融合蛋白を大量精製し選択的細胞内取り込みを確認しえた。 癌幹細胞標的療法は治療抵抗性癌を根本的に克服する革新的癌治療戦略として大いに期待される。これまで、癌幹細胞の発生起源は明確にされていなかったが、代表者らは、最近、CAPZA1過剰発現細胞が癌幹細胞の前駆責任細胞であることを報告した(Autophagy 2019)。そこで、本研究では、CAPZA1を標的し、胃癌幹細胞の発生を抑制し、かつ治療する技術を開発した。これまでの癌幹細胞を標的する癌治療戦略では、常に、分子標的マテリアルの開発に難航してきたが、本研究では、独自のmRNAディスプレイ法や膜透過促進ペプチドを駆使することでCAPZA1を標的するマテリアルを開発しえた。