Research projects

In this study, by using human-derived membrane permeation-enhancing peptides that we discovered and our mRNA display technology for in vitro selection of fragment antibodies and ligand peptides, we established elemental technologies for the development of revolutionary anticancer drugs that target intracellular targets that have not been targeted for biopharmaceuticals. First, using the mRNA display method, we created human VH single-domain antibodies that bind to marker proteins on the surface of cancer cells or intracellular disease targets. By combining these antibodies with the human-derived membrane permeation-enhancing peptides, we succeeded in cell-selective delivery of proteins, peptides and nucleic acids as biopharmaceutical models.

NASHは脂肪化・炎症・線維化を伴って進行し、肝不全や肝発癌発生の要因となる。本研究では肝微小環境の構造理解に基づく新たな代謝性肝疾患治療の確立を行う。肝類洞内皮で高発現するSema6AはSema6A-PlxnA2シグナルを介して肝星細胞の活性化を抑制し抗線維化治療分子として有用な可能性が示唆される。Sema6Aの肝類洞内皮における本来の生理機能を解き明かすことにより、肝再生機構、肝類洞の細動脈化機構、線維化、炎症の機転を解明する。類洞という肝微小構造の解剖学的特徴を利用し、効果的なSema6Aの投与方法を確立する。さらには、PlxnA2をターゲットとした新たな代謝性肝疾患治療を確立する。

Analysis of the mucosoid model, which is a two-dimensional development of gastric organoids, showed that butyric acid, a short-chain fatty acid with HDAC inhibitory activity, markedly increased CAPZA1 expression, and under H. pylori infection, CagA accumulated in a CAPZA1 expression-dependent manner. Furthermore, we confirmed the existence of commensal bacteria other than H. pylori that confer intragastric butyrate environment in human gastric juice. On the other hand, we obtained human VH single-domain antibodies that specifically bind to CAPZA1 and developed a technology that can deliver them into the nucleus while maintaining the binding activity of the antibodies. In addition, by using a ternary complex of luciferase gene/chitosan/hyaluronic acid, we obtained intracellular transduction of genes specific to CD44v9-positive cells, microtubule-dependent transport to the nucleus, and gene expression activity.

本研究では、申請者らが発見したヒト由来の膜透過促進ペプチドを利用したタンパク質・核酸の細胞質送達技術と、独自のmRNAディスプレイ法による小型抗体の試験管内選択技術を利用して、感染症の標的となる細胞内の因子に対するバイオ医薬の創出・送達手法を確立することを目的とする。これまで感染症に対するバイオ医薬の標的はウイルス・細菌の表面タンパク質や受容体など細胞外の分子に限られていたが、本研究を契機として、病原体の耐性獲得に左右されにくい細胞内の分子を標的とすることが可能になれば、我が国の感染症に対するバイオ創薬技術の基盤強化、ひいては国民の医療・福祉の向上に大いに貢献することが期待できる。 （1）HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田） 肝細胞特異的に発現しているアシアロ糖タンパク質受容体(ASGR)に結合する小型抗体やASGRのリガンドであるtri-GalNAcと、ヒトSyncytin1やIZUMO1由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したAgo2タンパク質をキャリアとして、siRNA医薬を肝細胞選択的に効率よく細胞質送達できる全く新しいDDSを開発するために、蛍光タンパク質をモデルとして共焦点顕微鏡観察することで、コンストラクトの最適化を進めた。また、DOCK11以外の新たな標的を見い出すために、野生型とAAV8-HBV1.3mer慢性感染モデルマウスの肝組織を用いたシングルセルトランスクリプトーム解析を行い、HBV関連遺伝子と宿主側の遺伝子を区別して空間的な情報を得ることができた。 （2）クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川） Axlの細胞内ドメイン(ICD)の様々な部位に結合する多様な小型抗体を１次セレクションし、その中から、所望の経路のみを活性化する小型抗体の２次スクリーニングを行うために、１年目は、Axl(ICD)の部分断片にビーズ固定用のタグを融合した遺伝子の発現用プラスミドを構築し、大量発現・精製した。Axl(ICD)断片が非天然変性領域を含むため苦労したが、ビーズへの固定を確認することができた。また、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルの亢進がTight-junctionの増強と同時に腸管上皮細胞における細胞増殖も増強することをin vitro感染モデル試験にてki67染色を指標に明らかにした。このin vitroモデルを小型抗体の2次スクリーニングに利用することで、細胞増殖の誘導を引き起こさない医薬品の開発が可能になると考えられる。 ASGRに結合する小型抗体やASGRのリガンドである tri-GalNAc と、ヒト Syncytin1 や IZUMO1 由来の様々な膜透過促進ペプチドを組み合わせて融合したタンパク質の肝細胞選択的な取り込みを確認できたこと、また、Axl(ICD) の各部位に結合する多様な小型抗体のセレクションに必要となるAxl(ICD) の部分断片を調製できたことから、おおむね順調に進展していると判断した。 (1) HBV感染細胞のcccDNAを完全駆除する核酸医薬の開発（土居・岡田） 前年度に引き続き、Ago2融合タンパク質とsiRNAの複合体をヒト培養細胞に添加し、肝細胞選択的に細胞内に送達されることを共焦点顕微鏡観察により確認することで、コンストラクトの最適化を進める。また、複合体が細胞質で標的mRNAを分解していることを確認するために、ヒト培養細胞の内在遺伝子やDOCK11に対するsiRNAとの複合体を肝細胞由来の培養細胞に送達し、培養細胞から抽出した標的遺伝子に対するmRNA量をRT-qPCRで定量する。さらに、前年度のHBV複製に関わる遺伝子情報の包括的解析から、核酸創薬に適した標的細胞から数種類の標的遺伝子まで絞り込み、先行したDOCK11の研究基盤データと比較して、新たな核酸創薬に最適な標的遺伝子を同定する。 (2) クレブシエラ菌感染を阻害する小型抗体医薬の開発（土居・津川） mRNAディスプレイ法により、すでに構築済みのヒト単一ドメイン抗体ライブラリーから、前年度に調製したAxl(ICD)に結合する小型抗体を試験管内選択する。その後、１次セレクションで得られた小型抗体を腸管上皮細胞由来 Caco-2細胞で発現させることでTight-junctionタンパク質の発現が変化するクローンを２次スクリーニングする。このときTight-junctionタンパク質のプロモーター細胞の構築と合わせて、クレブシエラ菌感染下におけるAxl/Gas6シグナルを確認し、クレブシエラ感染症予防に最適な２次スクリーニング技術を確立し利用する。

Although autophagy expression in H. pylori-infected cells is responsible for oncogenic CagA degradation and suppresses tumorigenesis, CD44v9-expressing cancer stem-like cells do not evoke autophagy and intracellular CagA accumulates. LAMP1-dependent autophagosome formation is also essential for CagA degrading autophagy, and we showed that CAPZA1 would bind to LRP1-ICD in the nucleus and inhibit LAMP1 expression, and when CAPZA1 is loaded on CAPZA1 overexpressing cells, CD44v9 expression was enhanced. In order to target CD44v9 and a large amount of CAPZA1 translocated to the nucleus, it was possible to release from intracellular foreign body degradation by combining TAT with human Syncytin 1-derived membrane-penetrating peptide S19. A large amount of protein was purified by fusing the created anti-CD44v9 single-chain antibody and a human-derived membrane-penetrating peptide, and CD44v9-positive cell selective cellular uptake was confirmed.