共同研究・競争的資金等の研究課題

間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cell: MSC）は骨髄、脂肪、胎盤組織から分離される多分化能を持つ幹細胞として再生医療の分野で注目されている。MSCが免疫を制御する機能を生かして、骨髄移植後の合併症である移植片対宿主病(GVHD)患者に対する培養MSCの点滴治療が保険収載された。一方で、応募者らは新鮮MSCが、慢性GVHD（cGVHD）モデルマウスにおける線維化を悪化させるという新しい知見を報告した。本研究では、①MSCの体内動態と分化能を解明し、②移植免疫モデルを用いて免疫応答における極性化の役割と機序を検証する MSCは多分化能を持つことが知られており、脂肪細胞、軟骨細胞、骨細胞や線維芽細胞に分化することが特徴とされている。In vivoではMSCは造血幹細胞の支持細胞として機能することや、組織の線維化に関与することも示唆されている。本研究はMSCがin vivo及びin vitroでCD45陽性マクロファージに分化することを証明し、免疫応答に関与することを示すことを目的としていた。ところが、我々はマウス新鮮MSCをマウスに戻すことで、一部の細胞がCD45陽性になることをみいだした。さらに、培養した場合でもマクロファージを誘導する条件を用いることでCD45陽性マクロファージになることを発見した。 マクロファージが造血幹細胞以外にも、間葉系幹細胞から分化することが事実であれば、既成概念を覆す発見である。また、様々な疾患の病態生理における役割も解明されれば、新規治療法の開発などに結びつく可能性がある。

我々は、マウス骨髄移植モデルにて、骨髄移植時にCD45陰性であったGFP標識新鮮間葉系幹細胞（MSC）が、骨髄移植後移植後にCD45陽性となったことを突き止めた。これらの細胞はMHC Class II陽性、かつCollagen I陽性であることから、いわゆるFibrocyte、あるいはマクロファージの特徴を備えた細胞であることが示唆された。そこで、新鮮間葉系幹細胞（MSC）はFibrocyteを経て線維芽細胞に分化する他に、MHC Class II陽性の抗原提示細胞に分化する可能性を示すため、昨年度は骨髄より分離したMSCを本来は造血幹細胞由来とされている樹状細胞やマクロファールなどの抗原提示細胞に分化するかを確認した。その結果、骨髄の新鮮MSCがCD45陽性細胞に分化することをin vitroで確認した。CD45陽性細胞はCD68とCD206も陽性であることも確認できており、マクロファージであることをほぼ同定した。さらに本年度は新鮮間葉系幹細胞をマクロファージに分化誘導した後に、Single Cell RNA解析を実施した。その結果、マクロファージマーカーを発現する細胞には２つの群が存在することが明らかになった。最終年度ではこの２群の細胞について詳細に検討をする。

本研究は、「ヒト歯髄由来純化間葉系幹細胞の各疾患に対する効果のProof of Concept（POC）の獲得」に加え、「ヒト歯髄組織に存在する純化造血系幹細胞の解析」を進める橋渡しプロジェクトである。医療廃棄物であり、毎日歯科医療機関で破棄されている抜去歯から、純化間葉系幹細胞と純化造血系幹細胞を分離し、組織再生メカニズムを免疫組織学的手法と画像解析によって明らかにし、骨・軟骨・筋疾患に対しては間葉系幹細胞、血液悪性疾患に対しては造血幹細胞による、安全で確実な歯髄幹細胞療法を確立することを目的としている。 本研究課題で開発するヒト歯髄由来MSCs/HSCs分離・培養システムは、これまでの研究をベースに、そのまま臨床応用可能な安全性と有効性を評価するために、「シンプルな幹細胞分離システム構築」・「ゼノフリー培養法による幹細胞機能維持の確認」・「疾患モデル動物への応用と、画像による定量化システムの構築」を目指す。 2021年度は、2020年度に本学倫理委員会に受理されたプロトコールを、実臨床で運用するフローを確立した。この流れは、本研究課題の目的である「医療廃棄物である抜去歯から、単一ポジティブマーカーを指標にヒトMSCsとヒトHSCsを分離し、その安全性と有効性を評価し、持続可能かつ安定した細胞治療製品の開発」を実現するために、極めて重要なステップであった。

ヒト歯髄組織由来LNGFRLow+THY-1High+ hDPSCs（human Dental Pulp Stem Cells; hDPSCs）、に集中した研究を行った。ゼノフリー間葉系幹細胞培地で培養した結果、hDPSCsにおいても、従来型培地と同様の細胞増殖能を確認できた。この実験結果によって①従来型の細胞の不均一性という問題を、特異的細胞表面マーカーによる均一な幹細胞分離を行うことで克服でき、また②「異種動物由来の血清成分」を使用しない「ゼノフリー培養」が可能であることも示唆された。 本研究課題によってhDPSCsの臨床応用の可能性が拡がったと考えている。 ゼノフリー間葉系幹細胞培地で培養した結果、LNGFRLow+THY-1High+ hDPSCsにおいても、従来型培地と同様の細胞増殖能を確認できた。これによって将来的には動物由来の血清を含まない培養液を用いる可能性が示唆された。この実験結果によって①従来型の付着培養分離型、あるいは浮遊培養分離型間葉系幹細胞のように「培養操作による細胞の不均一性」という問題を「特異的細胞表面マーカーによる均一な幹細胞分離」で克服でき、また②「異種動物由来の血清成分」を使用しない「ゼノフリー培養」が可能であることも示唆されたことから、本研究課題によって、hDPSCsの臨床応用の可能性が拡がったと考えている。