共同研究・競争的資金等の研究課題

マウスおよびヒトがん組織において、がん上皮細胞と周囲間質細胞を培養操作なしで分離・解析することに成功した。このことは間葉系幹細胞を予期的に分離するための表面マーカーが再生医療への応用だけに限らず、がん組織に存在する悪性間質細胞をも分離・評価する解析方法として有用であることが示唆された。

歯周組織の恒常性は局所の歯根膜細胞や歯槽骨細胞によってなされているが、移動してきた幹細胞様細胞が歯周組織の修復と再生に寄与している可能性があることが報告された。これらの細胞は骨髄間葉系幹細胞のマーカー（PDGFRa）を発現していた。歯周組織は発生学的に神経堤細胞にその起源を持つことからiPS細胞から神経堤細胞に誘導し、歯および歯周組織再生療法へつなげることを本研究課題の目標とし、以下の成果を得た。(1)ヒトiPSからの神経堤細胞誘導方法の確立。(2)誘導した神経堤細胞由来間葉系幹細胞の増殖能と骨・軟骨・脂肪・末梢神経系への分化能の確認。(3)誘導した幹細胞が遊走能を有していることが確認できた。

（1）実際の治療を目的として誘導されたiPS細胞、すなわちヒト治療用iPS細胞を用いることができるようになった。 (2) 少しでも将来の実用化に向けた治療用iPS細胞を使用することから、培養に用いるフィーダー細胞（動物由来栄養供給細胞）の使用も課題となっていることから本研究課題の重要なステップとして、フィーダーフリー培養法を確立した。フィーダーフリー培養法を確立した後は、同じく臨床実用化の重要なステップになる無血清培養法、すなわちゼノフリー培養法を確立した （3）フィーダーフリ/ゼノフリー培養法でのヒト治療用iPS細胞の維持と、歯周組織の発生学的起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。

本研究では、難治性疾患であるビスフォスフォネート製剤関連顎骨壊死（BRONJ）予防のための、歯髄幹細胞移植の有効性を検討することを目的としている。これまでに、ヒト歯髄幹細胞分離マーカーを同定し、フローサイトメトリーにより純化した歯髄幹細胞が高い増殖能および骨形成能を示すことを報告した。この歯髄幹細胞から3次元培養により作製したオルガノイドを、ビスフォスフォネート製剤投与後の免疫不全マウスの抜歯窩に移植し、顎骨壊死予防への有用性を評価する。 現在、3次元培養した歯髄幹細胞について、in vitroおよびin vivoでの実験を行い、様々な観点から顎骨壊死予防に関する効果を評価している。歯髄幹細胞移植が、どのように顎骨壊死予防に寄与するのかを明らかにするために、ビスフォスフォネート製剤投与後のマウス抜歯窩への歯髄幹細胞移植を繰り返している。主に組織学的評価およびマイクロCT撮影による画像評価を行い、移植による予防効果を検討している。また、リアルタイムPCRにより歯髄幹細胞の発現する細胞増殖因子や骨関連遺伝子、血管内皮細胞増殖因子、抗炎症因子について評価を行っている。 今後も、歯髄幹細胞に発現する因子について、リアルタイムPCRやELISA、Cytokine array等による評価を行う予定である。また、歯髄幹細胞移植による軟組織形成、血管新生、骨形成、抗炎症効果を、免疫染色やマイクロCT等を用いて評価する。

本研究では、口腔内マイクロバイオーム由来の炎症誘導性細菌の同定と制御性T細胞（regulatory T cell, Treg）の機能解析を行い消化器癌の進展における関与を解明することを目的とする。 歯周病モデルの作製について、本研究では、C3H/HeNJclおよびDBA/2JJC1実験マウスを用いて縫合糸を用いた歯頸部結紮法により歯周病感染を誘導する実験を行った。歯周病モデルにおける腫瘍の生着と増殖の検証について、歯頸部結紮法により歯周病を誘導したC3H/HeNJclおよびDBA/2JJC1マウスを用いてマウス由来の腫瘍細胞であるLM8およびKLN205をそれぞれ背部皮下に105cells移植を行い腫瘍細胞の生着と増殖の観察を行った。腫瘍細胞の移植４週間後に背部に形成された腫瘍組織の重量を計測した結果、歯周病群において腫瘍形成が亢進している傾向が確認された。 次に、潰瘍性大腸炎関連大腸癌と歯周病の関連については、潰瘍性大腸炎関連大腸癌（UC関連大腸癌）は大腸での炎症を背景として発生する癌である。今回、UCマウスモデルとして良く用いられているデキストラン硫酸ナトリウム（DSS）誘発性炎症性腸疾患モデルを用いて、歯周病が腸内の炎症に及ぼす影響を検討した。その結果、歯周病を起こしたマウスではDSSによる炎症がより強く起こることが分かった。このことは、歯周病が腸炎を増悪させ、UC関連癌発生リスクを上昇させる可能性を示唆した。今後は炎症を惹起させる原因となっている免疫細胞に着目し、さらなるメカニズム解明に繋げる予定である。

口腔扁平上皮癌においてCD44の発現が単なる癌幹細胞表面マーカーのみならず、機能的に重要 であることを明らかにした。特にvariantの発現が転移に関わる癌幹細胞マーカーとして有用で あることが示唆された。また、ヒトの口腔癌においても、マウスのリンパ節転移巣に見られたように周囲の環境に由来する分化刺激に対し抵抗性を持ち、静止期に留まり維持されるCD44陽性の 癌細胞が存在することが、再発や治療抵抗性にも関与していることが示唆された。

現在のがん治療は臓器特異的であり、いまだ多くの領域で、腫瘍の性質ではなく発生部位で治療法が決まっている。悪性度の違いによる治療法の選択基準がなく、特に低分化癌において従来の抗がん剤に抵抗性を示し、予後不良となることが問題となっている。申請者らはこれまでに、癌の悪性度及び治療抵抗性に関わるEMT/癌幹細胞マーカーCD44vの口腔扁平上皮癌における機能的役割の解析を進めてきた。また、癌間質に着目し、上皮のみならず間葉細胞を標的とした治療の可能性について検討してきた。そこで本研究では、難治性の低分化癌を中心とした口腔扁平上皮癌において遺伝子パネル検査および分子レベルでの解析を加え、 CD44vの発現と新規マーカーによる悪性度に基づいた個別化治療の確立を目指す。 本年度は昨年度に引き続き、当科で手術した口腔扁平上皮癌の検体において実施された遺伝子パネル検査の解析結果と病理組織像の違いについての検討を行った。これまでの解析結果から、病理組織像の違いと遺伝子変異数についての相関がみられることがわかった。難治性の低分化癌に特異的にみられる遺伝子変異、特異的なマーカーについて、さらに解析を進めているところである。

セツキシマブ耐性口腔扁平上皮癌の癌間質・間葉系細胞に着目し、CD44vと新規間質マーカーの発現プロファイルの構築による個別化治療を目的とした。臨床検体より未分化なセツキシマブ耐性口腔扁平上皮癌（SpCC）の解析を行ったところ、上皮マーカー：EpCAMと間葉系マーカー：PDGFRαを発現する細胞が存在した。いずれにもがん幹細胞マーカーCD44vが存在することが明らかとなった。 SpCCの検体を用いて間質特異的細胞表面マーカーやその細胞特性評価を行い、病理診断のみでは予測できない細胞の性質や機能を明らかにした。その上で、効果的薬剤が定まっていないSpCCに対するイマチニブによる新規治療の可能性を見出した。

本研究ではフィーダーフリー・ゼノフリーiPS培養法から、歯周組織の起源である神経堤細胞への誘導を実現させた。マウスの歯根膜組織には神経堤細胞が存在し、その一部は間葉系幹細胞マーカーであるPDGFRαやCD44が発現していることを確認した。そのため神経堤由来間葉系幹細胞は歯周組織再生療法の有力な細胞供給源になる可能性が示唆された。これらの細胞を実際の歯周病モデルマウスに移植するべく、その疾患モデルマウスの作製とその評価を行った。マウスの大臼歯に絹糸を結紮することで骨破壊を誘導するというきわめて臨床の歯周病に近い歯周病誘発モデルの再現実験を行い、その技術的再現性を確認し移植実験の準備をしている。

本研究課題はiPS細胞から神経堤細胞を誘導し、損傷神経組織の機能回復を目指す戦略を立てた。将来的な細胞治療を念頭に置き、動物由来の成分を使用しないフィーダーフリー、ゼノフリーでのiPS細胞培養法と、その状態から神経堤細胞への誘導方法を確立した。誘導した神経堤細胞集団が実際に末梢神経損傷を回復させるポテンシャルを有するかどうかを検証するため、坐骨神経切断モデルの作製とその機能評価に着手した。移植した誘導神経堤細胞は間葉系幹細胞の性質ももっていることがわかっており、移植実験においても末梢神経マーカーを発現しつつ、血管内皮細胞も再生神経組織内に誘導できていることを確認できた。

MSCの自己複製能を制御する分子機構としてWnt/Notchによる未分化性維持機構が提唱されている。研究では哺乳類の発生において自己複製と分化をコントロールしながら高次機能という複雑な組織構築に寄与することが知られる幹細胞の時間空間的な制御に関わるWnt, Notch,シグナルを可視化することにより、Wnt/Notchがどのように役割を分担し、あるいは他の分子と相互作用し、自己複製に関わっているのかを解析することで、MSCの自己複製および細胞系譜決定機構を明らかにする試みを行った。

既存の歯周組織再生療法や骨増生術は一定の効果を上げているものの、安全性や適応外使用、臨床的ハンドリングなどの改善点を多く抱える。本研究では、開発中のβTCP＋ポリ乳酸＋炭酸カルシウムの骨リモデリング機能を強化させ、さらに生体に内在する間葉系幹細胞を再生させたい場所に誘導する「間葉系幹細胞誘導システム」を付与することで、動物由来材料から脱却した骨リモデリング機能を有する幹細胞誘導型硬組織再建・再生材料の開発を目指す。外部から細胞移植を行うことなく骨再生治療を達成することから、医療機関の全てで使用することが可能であり、口腔領域に限らず、「骨」を対象とする整形外科や形成外科での実用を可能にする基盤研究を行うことを計画した。2020年度は当初予定していた産学連携共同研究施設の変更が行われ、幸いにも本プロジェクトに賛同してくださる新たな産学連携研究施設の目処がついた。また新たに他大学との共同研究計画も立ち上げ、生物材料に依存しない新規骨補填材の開発および、口腔領域疾患への応用を展開していくこととなった。2021年度は共同研究者とげっ歯類での大型動物を用いた顎骨欠損モデルを確立することに注力し、現在新規骨補填材料の評価系を構築するべく、臨床で用いられている（適応が認められている）ガイストリッヒ バイオオス, b-TCP, 炭酸アパタイトを用いて、自家骨置換率を組織化学的に検証しており、来年度の新規補填材料との比較実験に進む予定である。また来年度にはラット顎骨欠損モデルも確立することで、分子生物学的にも検証手段の方法が拡がり、骨置換部分の間葉系幹細胞の動態を評価する予定である。

本研究の目的は歯周炎や口腔インプラント周囲炎に対し、「自家骨に匹敵する骨誘導能と抗菌機能を兼ね備えた人工骨」と「バイオフィルム抗菌機能と歯肉軟組織結合性インプラント」を開発し、疾患モデルで治療効果を評価し、臨床研究へのProof of Conceptを獲得することである。生体内における間葉系幹細胞（Mesenchymal stem cells: MSCs)の役割は胎生期、そして生後の骨・軟骨・脂肪、その他間葉系組織細胞の補充と、組織リモデリングである。しかし、実際にこの「組織リモデリングや創傷治癒を担っているMSCsを、混ざりものなく、生きた状態」で分離することは、特定の細胞表面マーカーで分離してくること以外の方法は現時点では存在しない。現在の主流である組織培養分離法で集められた間質細胞集団に含まれる「組織リモデリングを担う、本当のMSCs」は非常にわずかであり、PDGFRαやCD271、Leptin receptorなどの指標なくして、生体内におけるMSCsを評価すること不可能である。本研究課題では、内在性の間葉系幹細胞を活性化させ、組織欠損部に集積あるいは欠損部位に遊走させる再生材料の開発を進めており、抗菌作用と自家骨置換能、そして骨誘導能を有する新しい骨再生材料の開発とラット顎骨欠損モデルへの応用を検証している。これまでの先行研究にて有用と考えられていた顎骨欠損モデルに対して、材料を移植しないモデルのビラヌエバボーン染色を行った結果、予想に反して十分な骨再生を確認することができた。既報のモデルによる顎骨欠損は、骨補填材料の形状として考えられる顆粒、ペースト、膜状構造体など、様々な形態の材料に対する定量的な評価が可能であるとされていた。しかし私達の実験結果では何も移植しない、すなわちコントロールの状況でも組織学的に骨の再生が認められたことから、間葉系幹細胞遊走体＋骨補填材料の評価系としてはふさわしくないという結果を得た。

本研究では、難治性疾患であるビスフォスフォネート関連顎骨壊死予防および治療のための歯髄幹細胞移植の有効性を検討することを目的として研究を行った。これまでにヒト歯髄幹細胞分離マーカーを同定し、フローサイトメトリーにより純化した歯髄幹細胞が高い増殖能および骨形成能を示すことを報告した。本研究では、ビスフォスフォネート投与後に抜歯を行った免疫不全マウスに純化歯髄幹細胞を移植することで、顎骨壊死を予防する能力があることが示唆された。 ビスフォスフォネート製剤等の骨吸収抑制薬により顎骨壊死を生じることが報告されている。抜歯が発症リスク因子とされ、骨吸収抑制薬投与前の抜歯と口腔ケアが重要と考えられているが、実際には投与後に抜歯を必要とする機会は少なくなく、顎骨壊死予防の有効な手段の確立が望まれる。また、顎骨壊死を生じた際には外科的に顎骨切除を行うことがあり、切除部の再生療法の開発が望まれる。本研究では、予期的に分離したLNGFR(Low+)THY-1(High+)DPSCをビスフォスフォネート関連顎骨壊死（BRONJ）モデルマウスに移植し、抜歯後の顎骨壊死予防への有効性を評価した。

従来法(骨髄細胞付着培養分離法)に比べ約120, 000倍の効率でマウスMSCsを直接精製する方法を確立した。さらに特に、骨髄MSCsにおいてその一部が神経堤由来であることを突き止めた。また、これら純化したMSCsは近年報告されて再生医療への応用が期待されている人工多能性幹細胞(Induced pluripotent stem cells ; iPS cells)になりやすいということを明らかにした。光硬化性ゼラチンは低分子量化体に改良したことで硬化前は室温下においても適度な粘性を有し、操作性が向上したことにより様々な骨欠損状態に合わせた形態が容易に付与可能と考えられ、光硬化によって要求される機械的強度で形状は保持可能となった。