共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究において口腔粘膜に生じる難治性自己免疫疾患である尋常性天疱瘡の自己抗体の解析を行った。その結果、天疱瘡には様々な病原性を有する自己抗体が存在する事をモノクローナルなレベルで確認した。また、自己免疫疾患における自己免反応性IgM抗体の詳細を解析するために、IgMクラスの天疱瘡モノクローナル抗体を作製し、IgMクラスの自己抗体には明らかな病原性がないことを確認した。これらは天疱瘡発症機序を解明する上で重要な知見となる。

天疱瘡における抗Dsg3IgM抗体の詳細な解析を実施した。天疱瘡患者血清中では、病初期血清中には明らかな抗Dsg3IgM抗体は検出されなかった。また天疱瘡モデルマウスでは、発症初期における抗Dsg3 IgM抗体産生が確認されたが、抗Dsg3IgG抗体と比較すると有意な上昇ではなかった。ヒト培養角化細胞を用いたassayおよびマウスを用いた天疱瘡における抗Dsg3IgM抗体の発症抑制と治療効果の検討を行い、現時点では両効果ともにコントロールと比較して明らかな差は確認されていないが、今後評価系確立への条件検討が必要であると考えられた。本研究は天疱瘡の発症機序解明、治療法開発に有用なデータになる。

これまでに報告されている共焦点顕微鏡と3D構築ソフトを用いたマウス耳介上皮におけるタイトジャンクションの観測方法を基本として、より口腔粘膜上皮に適したタイトジャンクションの観察方法を確立するために染色時間や試薬濃度のといった条件を検討した。その結果、1次染色時間を増加することで従来の方法よりもより鮮明にマウス口腔粘膜のタイトジャンクションの構成タンパク質であるClaudin-1、Claudin-4や裏打ちタンパク質であるZO-1の観察が可能となった。

本研究では、天疱瘡における自己抗体を産生するB細胞を検出する方法を組換え天疱瘡抗原を用いたELISPOT法により確立することを目的とする。末梢血中に存在する天疱瘡抗原特異的B細胞の数が、病勢と相関するか検討し、B細胞を標的とした治療法の開発の基礎的データとする。さらに、自己抗体産生におけるT細胞、B細胞の相互作用を検討するために、in vitroにおける自己抗体産生系を構築することを目的とする。昨年度までは、尋常性天疱瘡抗原(Dsg3)に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を陽性細胞として用いて、組換えDsg3を抗原としたELISPOTによる検出系を確立した。さらに、組換えDsg3にて免疫したマウスの脾臓、リンパ節、骨髄および、末梢血から単核球を分離し、Dsg3組換え抗原蛋白を用いたELISPOT法により、各臓器中に含まれるDsg3特異的抗体を産生するB細胞の算定した。また、我々の開発した天疱瘡モデルマウスにおける抗体産生細胞をELISPOT法により検出し、経時的変化を検討した。本年度は天疱瘡患者末梢血より分離された単核球を組み換えDsg3蛋白とマイトジェンにて刺激後ELISPOT法を行うことによりメモリーDsg3特異的B細胞を検出し、in vitro抗体産生系を開発した。このin vitro抗体産生系はT・B細胞の相互作用の解析などにも有用であると考えられた。

尋常性天庖瘡(PV)はその自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する抗Dsg3抗体により水庖が形成される。これまでに我々はPVモデルマウスより抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)を複数単離し、新たな病原性を評価する方法として抗原と抗体の結合カイネティクスに注目し、表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いてAK mAbとマウスDsg3蛋白及びヒトDsg3との結合解離係数(K_D)を算出し解析を行った。その結果マウスDsg3に対するK_D値は1.38×10^<-8>から4.81×10^<-10>で個々のmAbは異なるアフィニティを有していたものの、AK mAbのIn vivoにおける病原性と明らかな相関は認めなかった。そこで次にヒトDsg3に対するKn値を測定したところ5.61×10^<-7>から2.55×10^<-10>と同様に異なるアフィニティを有し、さらにmAbの結合アフィニティはin vitro dissociation assayを用いて検討した病原性と相関関係を有する事が確認された。実際の天庖術自己抗体はポリクローナル抗体であり、複数のエピトープが異なる抗Dsg3抗体が結合していると考えられる。そこで本度は異なる手法で作製したPVモデルマウスより単離した抗Dsg3mAb(NAK mA b)を用いて解析を行った。その結果異なるエピトープを認識するNAK1 mAb、NAK2 mAb、NAK7 mAb、NAK11 mAbを続けてアナライトとしてinjectionしたところNAK1 mAbとエピトープの競合するNAK7 mAbの結合は見られなかったものの、その他のNAK mA bは同時にDsg3分子上に結合できることが確認された。この結果よりIn vivoにおいても異なるエピトープを認識するDsg3抗体がDsg3分子上に同時に結合し接着障害を誘導している可能性が考えられた。以上より、Biacoreを用いた結合カイネティクス解析は天庖療の水庖形成機序の解明に有用な方法であると考えられた。

天疱瘡は粘膜と皮膚に生じる自己免疫性の水疱形成疾患である。尋常性天疱瘡患者は全例で口腔粘膜に水疱を形成する。天疱瘡の病態には自己抗体の病原性が大きく関与しており、自己抗体価と病勢には一定の相関関係が認められることが確認されている。しかし実際の臨床では抗体価と病気の重症度が一致しない症例が数多く存在する。そこで本研究では天疱瘡自己抗体の新たな病原性評価法を開発し臨床応用を目指すことを目的とした。