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Pemphigus vulgaris is an autoimmune blistering disease of oral mucosa. We analyzed pathogenic activity of pemphigus antibodies monoclonal level. In patient serum, the pemphigus autoantibody that has heterogenous pathogenicity was confirmed. We also analyzed the pemphigus IgM autoantibodies as monoclonal level. We confirmed that pemphigus IgM antibody did not have apparent pathogenic activity. These finding will dissect the pathophysiolosical mechanism of pemphigus.

e analyzed the anti-Dsg3 IgM antibody in pemphigus. In early stage of pemphigus patient serums, apparent anti-Dsg3IgM antibody was not detected. In PV model mice, anti-Dsg3 IgM antibody production in the early stage of the onset of PV was confirmed, however it was not significant than anti-Dsg3 IgG antibody production.Furthermore, we conducted examination for in vivo and in vitro analysis. The in vitro dissociation assay using normal human culture keratinocyte and the passive transfer assay using mouse were performed to confirm the preventive effect and therapeutic effect of the anti-Dsg3 IgM antibody. There are no apparent differences between subjects and controls for both effects. The detailed and continuous examination will be necessary in future. These results are useful for dissection of pathophysiology of PV and development of therapeutic strategy of PV.

On the basis of the reported cofocus microscope and observation method of the tight junction in the mouse auricle epithelium using the 3D construction software, I examined a condition such as one of reagent density so far at dyeing time to establish the observation method of the tight junction suitable for an oral mucosa epithelium more. As a result, observation of ZO-1 which was Claudin-1 which was the constitution protein of the tight junction of the mouse oral mucosa than a conventional method more clearly, Claudin-4 and lining protein was enabled by increasing primary dyeing time.

本研究では、天疱瘡における自己抗体を産生するB細胞を検出する方法を組換え天疱瘡抗原を用いたELISPOT法により確立することを目的とする。末梢血中に存在する天疱瘡抗原特異的B細胞の数が、病勢と相関するか検討し、B細胞を標的とした治療法の開発の基礎的データとする。さらに、自己抗体産生におけるT細胞、B細胞の相互作用を検討するために、in vitroにおける自己抗体産生系を構築することを目的とする。昨年度までは、尋常性天疱瘡抗原(Dsg3)に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞を陽性細胞として用いて、組換えDsg3を抗原としたELISPOTによる検出系を確立した。さらに、組換えDsg3にて免疫したマウスの脾臓、リンパ節、骨髄および、末梢血から単核球を分離し、Dsg3組換え抗原蛋白を用いたELISPOT法により、各臓器中に含まれるDsg3特異的抗体を産生するB細胞の算定した。また、我々の開発した天疱瘡モデルマウスにおける抗体産生細胞をELISPOT法により検出し、経時的変化を検討した。本年度は天疱瘡患者末梢血より分離された単核球を組み換えDsg3蛋白とマイトジェンにて刺激後ELISPOT法を行うことによりメモリーDsg3特異的B細胞を検出し、in vitro抗体産生系を開発した。このin vitro抗体産生系はT・B細胞の相互作用の解析などにも有用であると考えられた。

尋常性天庖瘡(PV)はその自己抗原蛋白であるデスモグレイン3(Dsg3)に対する抗Dsg3抗体により水庖が形成される。これまでに我々はPVモデルマウスより抗Dsg3モノクローナル抗体(AK mAb)を複数単離し、新たな病原性を評価する方法として抗原と抗体の結合カイネティクスに注目し、表面プラズモンセンサー(Biacore)を用いてAK mAbとマウスDsg3蛋白及びヒトDsg3との結合解離係数(K_D)を算出し解析を行った。その結果マウスDsg3に対するK_D値は1.38×10^<-8>から4.81×10^<-10>で個々のmAbは異なるアフィニティを有していたものの、AK mAbのIn vivoにおける病原性と明らかな相関は認めなかった。そこで次にヒトDsg3に対するKn値を測定したところ5.61×10^<-7>から2.55×10^<-10>と同様に異なるアフィニティを有し、さらにmAbの結合アフィニティはin vitro dissociation assayを用いて検討した病原性と相関関係を有する事が確認された。実際の天庖術自己抗体はポリクローナル抗体であり、複数のエピトープが異なる抗Dsg3抗体が結合していると考えられる。そこで本度は異なる手法で作製したPVモデルマウスより単離した抗Dsg3mAb(NAK mA b)を用いて解析を行った。その結果異なるエピトープを認識するNAK1 mAb、NAK2 mAb、NAK7 mAb、NAK11 mAbを続けてアナライトとしてinjectionしたところNAK1 mAbとエピトープの競合するNAK7 mAbの結合は見られなかったものの、その他のNAK mA bは同時にDsg3分子上に結合できることが確認された。この結果よりIn vivoにおいても異なるエピトープを認識するDsg3抗体がDsg3分子上に同時に結合し接着障害を誘導している可能性が考えられた。以上より、Biacoreを用いた結合カイネティクス解析は天庖療の水庖形成機序の解明に有用な方法であると考えられた。

Pemphigus is an autoimmune blistering disease of skin and oral mucosa. The all of patients with pemphigus vulgaris have a blister in oral mucosa. Many of cases, pathogenic activity of the autoantibody correlate with clinical phenotype of the pemphigus, and it is confirmed their correlation. However, there are many cases that severity of clinical phenotype does not correlate with antibody titers. Therefore, we tried to develop a novel system to measure the pathogenic activity of the pemphigus autoantibody in this study.