共同研究・競争的資金等の研究課題

肝移植時の重篤な合併症の1つに肝虚血再灌流血流障害があり、いまだ解決されていない課題である。虚血再灌流は、高度な炎症反応、血管内皮細胞傷害、微小循環障害を惹起し、臓器障害に進展するとともに、急性細胞性拒絶反応も増悪する可能性が考えられている。一方、近年、組織/器官障害に対する新しい治療法として幹細胞の応用が期待されている。本研究では、ラット肝虚血再灌流障害モデルおよび肝移植モデルを用いて、高い幹細胞活性と多様な生理活性等を有する間葉系幹細胞/間質細胞株(ASCL)の有用性を検証する。虚血再灌流障害を抑制し、肝移植の新たな治療法を開発することを目的とする。 ラット肝虚血再灌流モデルにおいて、虚血開始24時間前にコントロール(生理食塩水)、ASC、ASCLをそれぞれ脾臓注入したモデルを作成した。120分虚血後の生存率は、無治療のコントロール群と比べ、ASCL又はASCの前投与群では生存率が有意に上昇した。60分虚血後のAST/ALT値は、再灌流3時間後ではASCL群はコントロール群と比較し有意に低下した。HE及びTUNEL染色ではコントロール群と比較し、ASCL及びASCs群ではアポ トーシスと組織障害が明らかに軽減した。ASCLはin vivoにおいても抗炎症性サイトカインを発現すること により、虚血再灌流障害を抑制する可能性が示唆された。 本研究で使用するASCLは、国際細胞治療学会が定める間葉系幹細胞の定義を全て満たしており、既に医療応用されている他の間葉系幹細胞と同様、高い安全性を有している。一方、従来の間葉系幹細胞の採取方法では、完全に均一な性質を持つ細胞集団を得ることが困難であったが、ASCLはこの課題を克服している。本研究は、これまでの国内外で実施されてきた研究とは異なる世界初の研究である。本研究結果からASCLは肝虚血再灌流障害を抑制することが示唆され、実臨床の肝移植手術における応用が期待される。

本研究の対象疾患は包括的高度慢性下肢虚血(以下CLTI)である。本邦で0.2mmまでの微細血管を無侵襲で描出できる新たなモダリティとして、光超音波イメージングが開発された。本研究の目的は、潰瘍局所の微細血管を血行再建前後で光超音波イメージングで評価し、治癒が得られる潰瘍と治癒が得られない潰瘍の間にどのような血管構造の差異があるのかを人工知能(AI)技術を用い見いだし、血行再建後の潰瘍治癒予測モデルを作成することである。潰瘍治癒が期待できなければ、早期再介入や切断をおこなうなどの臨床判断を可能にすることで治療期間を短縮でき、患者負担の軽減および医療資源の大幅な節約につながると考えている。

多数箇所病変を有する包括的高度慢性下肢虚血肢（CLTI）患者に対して、中枢側病変から血管内治療を行い、標的とする部位のrSO2値をモニターしながら潰瘍治癒が見込まれる値をカットオフ値として、それを超える値を得た場合には末梢の動脈病変にはそれ以上治療を加えないという血管内治療戦略“標的組織酸素飽和度を指標としたCLTI患者に対する血管内治療(TOE)”の是非を調査するため、多施設無作為化非盲検（標準治療対照）並行群間比較試験 (RCT)を計画し、スタートさせる。 末梢動脈疾患（PAD）の重症病態である包括的高度慢性下肢虚血（CLTI）では潰瘍、壊死などを引き起こし、最悪の場合下肢切断に至る。これを防ぐための血行再建として血管内治療（EVT）が用いられる。EVT の効果を評価する従来の方法には足首上腕指数（ABI）、皮膚灌流圧（SPP）、経皮酸素圧（TcPO2）があるが、いずれも術中モニターには適さない。我々は近赤外分光法（NIRS）技術による術中の四肢血流評価に注目し、組織内の酸素化ヘモグロビンと脱酸素化ヘモグロビンの濃度を測定し、局所組織酸素飽和度（rSO2）を計算して重症度指標となることを示してきた。 多数箇所病変を有する包括的高度慢性下肢虚血肢（CLTI）患者に対して、中枢側病変（腸骨動脈や大腿動脈病変）から血管内治療を行い、標的とする部位のrSO2値(%)をモニターしながら潰瘍治癒が見込まれる値はいくつかのカットオフ値の探索を目的として症例検討を重ねた。ラザフォードグレード5 または6 の患者を対象とし、潰瘍治癒の目安としては、術後１年間の外来でのfollow-upの結果から、術中のEVTにより上昇したrSO2値と術後3,6,12ヶ月後の潰瘍治癒、救肢率の結果をretrospectiveに検討し、EVTにより上昇した術中rSO2値と術後のfollow-upでの潰瘍治癒についての検討から救肢の指標となる術中rSO2値のcut-off値の探索を行った。その結果、1 年以内の創傷治癒に対する術前のrSO2のカットオフ値は44%（感度: 66.7%、特異度: 78.9%）でEVT 中のrSO2 のカットオフ値は47%（感度: 86.7%、特異度: 73.7%）であった。このことより、EVT術中のrSO2 値が47%以上となれば、その後1 年以内に創傷治癒する可能性が高いと考えられた。 血管内治療時の目標とするオキシメータが示す組織酸素飽和度については、カットオフ値が示さレ、今後の治療症例のメルクマールとすることが可能となったが、多数箇所病変を有する包括的高度慢性下肢虚血肢の症例数の集まりが悪く、研究に遅れを招いている。 研究対象である多数箇所病変を有する包括的高度慢性下肢虚血肢の症例数の増加を検討するが、同時に目標とする組織酸素飽和度のカットオフ値設定については、包括的高度慢性下肢虚血肢だけではなく、他の虚血性疾患、例えば急性動脈閉塞肢や、糖尿病性壊疽など疾患の範囲を拡大させることも検討している。

低侵襲な血管内治療が全盛の現在においても、重症虚血肢の血行再建では外科的バイパス術が重要な位置を占めている。しかし術後早期に自家静脈グラフトや吻合部に内膜肥厚による狭窄をきたす症例が少なからず存在し、有効な予防策が存在しない。本研究では、ラット腹部大動脈擦過モデルを用いて、高い幹細胞活性と多様な生理活性を有する間葉系幹細胞／間質細胞株（Adipose-derived Mesenchymal Stem/stromal Cell Line：ASCL）の血管内膜肥厚抑制に対する有用性を検証する。また標的部位への細胞治療効果を高めるための移植法として、ASCLの細胞シートを作製しその効果を検証する。 ラット皮下脂肪組織由来の間葉系幹細胞／ 間質細胞株（ASCL）を樹立し、間葉系幹細胞の条件を満たすことを確認し得た。温度応答性細胞培養皿を用いてラットASCLの単層細胞シートを作製し、細胞シート回収用支持体を用いた検討を加え、より確実な細胞シートの回収が可能になった。ラット腹部大動脈擦過モデルにおいて、内膜肥厚のピークを検証し、擦過後2週間で内膜肥厚抑制効果の検討を行うこととした。ラットASCL単層シートの擦過部血管外膜への貼付実験では、コントロール群と比して内膜肥厚が抑制される傾向が示唆されつつある。 本研究では、われわれの独自技術により精製・株化された、均一な性質の間葉系幹細胞集団であるASCLの細胞シート化に成功した。そして、動物モデルにおいて、その細胞シートの血管外膜への貼付による血管内膜肥厚の抑制が期待される結果が得られつつある。本細胞シートが開発されれば、患者負担を増やすことなくバイパス術の開存率を改善することが期待できる。重症虚血肢の患者の下肢切断リスクを回避し、頻回の再治療を回避することによる医療費の抑制にも貢献し得る