共同研究・競争的資金等の研究課題

マウスにおいて、非視覚光受容体のOpn5が、バイオレットライト(360 - 400 nm)を介して近視進行を抑制することが明らかになったが、Opn5がどのような脳内回路を経て、眼軸長伸長の抑制や脈絡膜厚の維持など近視の抑制に働いているのかは、明らかになっていない。そこで、本研究では、国内のグループで開発された単純ヘルペスウイルスのBACを改変することにより、順行性の経シナプスの神経細胞トレーサーを開発し、Opn5陽性網膜神経節細胞からの脳内の神経回路網を明らかにすることを目的とする。本研究により、近視抑制の脳内回路の解明が進むことで、将来的な近視の予防や治療法の開発に貢献することが期待される。

RNA結合タンパク質Quaking(Qki)が、網膜前駆細胞とミュラーグリア細胞において強く発現しているが、網膜での機能は明らかになっていない。本研究では、ES細胞やiPS細胞といった多能性幹細胞からの3次元網膜分化法を網膜初期発生の迅速な遺伝子機能解析の実験系とすることで、網膜初期発生におけるQkiやQkiの標的遺伝子の役割を明らかにしたい。Qkiに着目した網膜初期発生の分子機構の解明により、網膜発生や分化の理解が深まることで、将来的に網膜分化系の改良など再生医療や創薬のための重要な基礎研究となることが期待される。 CRISPR/Cas9法により、マウスES細胞株で、Qkiノックアウトクローンを1クローン単離することができた。タンパク質、DNAの回収を行い、ウエスタン解析・シークエンス解析によってQki遺伝子の破壊の確認を行ったところ、このクローンにおいてQkiのノックアウトが確認された。この株においては、細胞増殖能は、野生型と同様で、NanogやOct4といった幹細胞の未分化マーカーが発現していることから、この株は未分化維持されており、通常のES細胞と同様に増殖することが分かった。このQkiノックアウトクローンを3次元網膜に分化させたところ、初回は、網膜様構造への分化が停止するという表現型を得たが、2回目以降は、網膜様構造が観察され、野生型細胞が混入したためなのかなど、3次元網膜の表現型についてはっきりとした結論がだせていない。このため、別のQkiノックアウトクローンの単離を行うことにした。現在、別のQkiノックアウトクローンの単離中である。また、Qki KOマウスを理研BRCより入手した。Qki KOマウスは、胚性致死であるが、致死になるE9.5-E10.5における眼の表現型については報告されていないため、現在凍結切片により、E9.5でのQki KOマウスのホモ個体の眼について調査している。さらに、海外の研究者より、Qki floxマウスを取り寄せており、近日中にマウスの清浄化が終わるため、動物施設に搬入し、解析を開始する予定である。 単離できたQkiノックアウトクローンの3次元網膜の表現型がはっきりと確定できなかったため、再度、Qkiノックアウトクローンを単離することにした。このため、研究進捗状況について、やや遅れていると判断した。 引き続きQkiノックアウトクローンの単離を行う。もし、野生型とQkiノックアウトクローンについて、3次元網膜の表現型の差がみられるようであれば、Qki cDNAの過剰発現により、表現型が回復するかどうかを調べ、RNA-seq解析により、どのような遺伝子群の発現に差がみられるのかを解析する。Qki KOマウスについてE9.5でのQki KOマウスのホモ個体の眼の表現型の解析を実施する。さらに近日中に到着するQki floxマウスとDkk3-Creマウスを交配し、網膜前駆細胞で特異的にQkiを欠損させた網膜の表現型の解析を行う。

本研究により、ヒトのES/iPS細胞で報告されている網膜細胞への分化法をもとに、マウスES細胞からの新たな網膜細胞分化法を開発することができた。この網膜分化法は、マウスES細胞を解離したのち、胚様体を形成させ、この胚様体をマトリゲルコートした培養皿に入れたのち、マトリゲルを含んだ網膜分化培地を加え培養を継続するというもので、比較的簡便な分化方法である。当初の目的は、心筋で報告されているように、視細胞はミトコンドリア含量が高いことを利用して、網膜細胞分化系から視細胞を純化することだったが、視細胞を純化する方法の開発までには至らなかった。 多能性幹細胞(iPS/ES細胞)より、立体網膜や眼を構成する様々な細胞の分化誘導が可能になり再生医療への応用が進められている。本研究の当初の目的であった、視細胞はミトコンドリア含量が高いことを利用して、網膜細胞分化系から視細胞を純化する方法の開発までには至らなかったが、本研究によって開発できたマウスES細胞からの新たな網膜細胞分化法は、比較的簡便であり、今後の眼科学分野の再生医療のための基礎研究のなかで、有用な手段の一つになることが期待される。