共同研究・競争的資金等の研究課題

サルコペニアは、寝たきりや要介護状態につながる主要な危険因子となっており、その予防は、健康寿命延伸の最重要課題の一つである。筋量維持は、サルコペニア予防に極めて重要であるため、ヒト骨格筋の恒常性維持機構の理解と、それに基づいた薬に頼らない筋萎縮予防の重要性が増している。本研究では、骨格筋が産生するメタボライトによるシグナル制御と骨格筋恒常性について解析を行い、サルコペニアをはじめとする筋萎縮の予防効果を有する食品成分の探索を行う。 加齢性筋萎縮症（サルコペニア）は、高齢者の寝たきりや要介護状態につながる主要な危険因子となっており、その予防は健康寿命延伸の最重要課題の一つである。また、骨格筋は、運動機能だけでなく、代謝の中心的な臓器としても重要な役割を担っている。したがって、筋量維持は、サルコペニア予防だけでなく、糖尿病をはじめとするメタボリックシンドロームの予防という面でも重要であり、ヒト骨格筋の恒常性維持機構の理解と、それに基づいた薬に頼らない筋萎縮予防の重要性が増している。臨床的知見や遺伝学的解析よりメバロン酸経路が骨格筋恒常性維持に重要な役割を果たしていることが明らかになっているが、その分子機構は十分に理解されていない。本研究は、骨格筋が産生するメバロン酸経路メタボライトによるシグナル制御と骨格筋恒常性について解析を行い、サルコペニアをはじめとする筋萎縮の予防やそれを可能にする食品成分の探索を行うことを目的としている。 本年度は、メバロン酸経路の律速酵素であるHMG-CoA還元酵素の特異的阻害剤であるスタチン及びスタチン+メバロン酸処理を行なったヒトiPS細胞由来骨格筋細胞のRNAシークエンス解析を行い、その発現変動遺伝子をコントロール群と比較検討した。その結果、ヒトiPS細胞由来骨格筋細胞においてメバロン酸経路依存的に発現が制御される複数の遺伝子及びパスウェイが存在することが示された。さらに、RNAシークエンス解析によって同定された遺伝子につき、定量PCRによる検討を行い、メバロン酸経路依存的に発現制御を受ける遺伝子を複数同定した。現在、これらの遺伝子の発現制御機構ならびに骨格筋における機能について解析を行っている。 ヒトiPS細胞より分化誘導した骨格筋細胞を用いて、メバロン酸経路依存的に発現制御される遺伝子やパスウェイをRNAシークエンスによって同定し、来年度以降、本研究を発展的に展開していく上で重要な基礎データを得ることができた。 本年度実施したRNAシークエンス解析によって同定されたメバロン酸経路依存的に発現が制御される遺伝子に着目し、解析を進める。具体的には、これら遺伝子の発現制御機構や発現に重要な役割を果たすメバロン酸経路メタボライトを同定する。また、これらの遺伝子の骨格筋における機能を解析するため、siRNAを用いたノックダウン実験やCRISPR-Cas9システムを用いたノックアウト実験を行い、骨格筋におけるメバロン酸経路の生理的な重要性について明らかにしていく。

本研究は、食品成分で化学修飾された血清タンパク質と相互作用する自然抗体の存在に着目し、食を起源とする抗原による自然免疫調節機能について検討する。まず、ファージディスプレイ法と次世代シーケンサーを組み合わすことで、対象とする抗原に親和性をもつ無数の抗体群を網羅的に解析する。その結果、特定の食品成分修飾タンパク質と相互作用する自然抗体配列の規則性や類似性を明らかとする。さらに、ウイルスや細菌などの病原体関連分子パターンを認識する自然抗体配列との関連性を探求する。 食品は生存に必須の栄養源であり、疾病予防にも重要な物質である。食品成分の中には生体内のタンパク質と化学反応することでその性質を変化させ、生体にさまざまな影響を与える可能性のあるものがある。例えば、ポリフェノールなどの食品成分で化学修飾された血清アルブミンは、生体内の自然抗体に認識されるということが報告されている。しかしながら、その機能の詳細についてはよくわかっていない。そこで本研究では、食品成分修飾タンパク質と自然抗体による相互作用が自然免疫を増強し、細菌やウイルスなどの異物に対しても一定の防御機構として働くという可能性について検討することを目的とした。 本年度は、食品成分によって化学修飾された血清アルブミンと相互作用する自然抗体をスクリーニングするために、ファージディスプレイ法を用いたマウス由来の一本鎖抗体（scFV）提示ライブラリーの構築を行った。具体的には、マウス脾臓細胞からmRNAを抽出し、逆転写、抗体遺伝子の増幅、ファージミドベクター（pSEX81）への挿入、大腸菌への感染を行うことで、scFV提示ファージライブラリーを得た。食品成分で修飾されたタンパク質は、緑茶カテキンの一種であるEGCGなどのポリフェノール類と血清アルブミンなどのタンパク質から調製した。固相化した修飾タンパク質にファージライブラリーを加え、親和性の高いscFV提示ファージを濃縮し、得られた抗体遺伝子の配列を解析した。現在は得られたscFVによる抗原認識の特異性についての検討を進めるとともに、異なるファージミドベクターを用いたFab抗体提示ライブラリーの構築にも着手している。 一本鎖抗体（scFV）提示ライブラリーの構築と、食品修飾タンパク質に対するライブラリーの適用を計画通り行うことに成功したため。ただし、現在までに得られた抗体配列は限定的であり、抗体の抗原特異性（または他抗原に対する交差性）に対する解析は現在進行中である。また、より信頼性の高い分析を行うために、当初予定していなかった異なるファージミドベクターを用いたFab抗体提示ライブラリーの構築を行うこととした。 EGCG以外の食品成分で修飾されたタンパク質や、細菌やウイルスなどに由来する分子を抗原としてより大規模な解析を行い、それぞれの結果を比較する予定である。また、得られた一本鎖抗体（scFV）がそれぞれの抗原に対してどのような交差性を示すのかをELISA法などの生化学的な手法によって明らかとする。さらに、新たにFab抗体提示ライブラリーを構築し、それぞれの抗原に対して親和性の高いFab抗体配列の解析も行う予定である。特に注目すべき抗体が得られた場合には、抗原と抗体の相互作用について、分子レベルでの解析も行いたい。

本研究では生体内で生成するアクロレインとの反応によって蛍光特性に変化が生じる機能性小分子の設計と合成を行った。まず、アジド基を蛍光色素の共役系炭素原子に直接結合した化合物を合成し、ニトロベンゾオキサジアゾール骨格を用いた場合において、アクロレインとの反応生成物のみが蛍光を発するような蛍光検出条件を設定可能であることを見出した。しかし、これらのアジド基には安定性などの面で問題も見られた。そこでさらに、スルファニル基によるアクロレインへのマイケル付加反応を利用した蛍光プローブについても検討した。 本研究は、生細胞内でのアクロレインのイメージングを可能とする分子プローブの開発を行うものである。生体内で生じるアクロレインは、生活習慣病や癌、そして老化とも密接に関わる危険因子として注目されている。したがって、アクロレインの生成を高感度に検出・イメージングすることができれば、これらの疾病や加齢のメカニズム研究、予防、診断などの役に立つことが期待される。

多くの細菌は、その細胞内にタンパク質の殻(シェル)で区画化された Bacterial microcompartment (BMC)と呼ばれる構造をもつ。BMCは特定の酵素を内包し、物質の合成・代謝装置として働く。BMCシェルを自在に利用できれば、物質の貯蔵、生産、輸送に関わるさまざまな応用が期待できる。そこで本研究では、これまで未開拓だったBMCシェルの人工利用への道を拓くことを目指し、BMC構成シェルタンパク質を改変することによって、標的とするタンパク質を取り込みながら自発的にシェルを形成する新たな機能性人工シェルの創成とその応用を試みる。

老化した細胞が組織内に蓄積し、老化関連分泌表現型(senescence-associated secretory phenotype ;SASP)を介して細胞非自律的に組織機能に影響を与えることが、加齢性疾患の発症や老化現象の原因と考えられている。皮膚においても、老化細胞のみを特異的に生体内からを除去することでSASPを抑制し、本質的な抗老化をもたらす治療法senolysisの概念が広まりつつある。 本研究は、細胞特異的な除去治療としてがん療法を応用し、特に光免疫療法および抗体薬物複合体治療を用いて生体からの老化細胞を除去することで、皮膚の老化を阻止し健康長寿の革新的な治療法の開発を目的とする。

細胞内のタンパク質の合成、分布、分解の制御は細胞の正常な機能を維持する上で重要である。タンパク質機能のon/offを人工的に切り替えることができれば、さまざまな生命現象の解明に役立ち、ドラッグデリバリーシステム（DDS）への応用も期待できる。そこで本研究は、外部刺激により任意のタンパク質機能を発現させる新規システムの開発を目的とする。具体的には、自己組織化により中空の球状構造を形成するタンパク質ケージ内部に標的タンパク質を閉じ込めることでその機能を無効化させ、特定の分子との相互作用または光照射などの外部刺激によりケージを崩壊させることで、内包タンパク質の機能を瞬時に発現させる系を構築する。

天然特化代謝産物生合成においては、生合成酵素の細胞内局在や複数の酵素間の相互作用を利用した生合成反応の制御機構による、選択的で効率的な物質生産が提唱されている。本領域では、このような超分子酵素複合体形成による生合成効率化、生合成反応制御機構を「特化メタボロン」と定義する。特化代謝産物生合成研究が進んだ現在においても未だ大きなブラックボックスに包まれている生合成制御機構の包括的な理解と利用に向けて、植物・微生物の特化メタボロンの構造機能を解析・比較し、自然における代謝効率化・基質受け渡し・天然物構造多様性構築機構とその進化を解明する。そしてその知見を基盤に自然を超える効率的物質生産系を確立する。

本研究では、特化メタボロンを構成する酵素間相互作用の検出に最適化した蛍光プローブ群を開発することによって「特化代謝効率化および反応制御機構の解明」に貢献する。さらに、これらプローブを標的酵素の特定の部位にラベル化、あるいは融合タンパク質として発現することで、酵素間相互作用に伴う局所的な粘性変化や立体反発を検出する手法として発展させる。これによって、これまで未解明であった特化メタボロンの構成酵素の同定、相互作用強度の定量、および植物、微生物内における特化メタボロンの可視化を目指す。