共同研究・競争的資金等の研究課題

本申請研究では，細胞表面の化学構造に特異的な人工抗体によって標的細胞を捕捉し，細胞の代謝によって消費，生成される化学種や反応熱に基づく光，電気，熱の信号変化をリアルタイム計測する手法を独自に開発する。これらの異なる信号に基づいた細胞情報の取得によって，標的細菌の活性を1細胞レベルで多角的に評価できる非培養系の検出原理を開発する。細菌の識別と活性評価を同時に達成する革新的手法の開発により検査の迅速化を実現し，安心安全で豊かな社会の形成に貢献する。 本研究では，細菌細胞の活性を多角的に評価する新しい検出原理を開発することを目的として，細菌特異性電極の開発とともに，細胞活性の高感度計測法の開発を行った。 アミノ基やカルボキシ基などの官能基を持つ分子，あるいは抗体などのレセプター分子を化学修飾した金属ナノ粒子構造体を開発した。構造体で標識した細胞を走査型電子顕微鏡観察した。構造体の粒径を分解能とした細胞表面解析を行った。抗O26抗体を修飾した構造体は大腸菌O26にのみ結合し，他の血清型大腸菌（O157）や黄色ブドウ球菌には結合しなかった。また，構造体で標識した細胞を暗視野顕微鏡で観察すると構造体の金属種によって異なる光散乱特性が得られ，このことから，構造体と抗体の組み合わせによって菌種の識別が可能になった。そこで，当初計画にはなかった光散乱に基づく細菌検出法の開発についても今後検討を行うこととした。 試料溶液中の細菌を捉えるために，化学修飾による自発結合性を利用して電極に細胞を濃縮・捕捉する機構について検討した。また，導電性高分子PPy膜を形成する際，重合反応に標的細菌を共存させ，細胞をPPy膜に固定することに成功した。溶菌によってPPyマトリクスに形成した人工抗体の選択性や自発結合性について検討した。マトリクスへの官能基（カルボキシ基）導入率を変化させたが，細菌の結合性に大きな影響は見られなかった。 細菌の生命活動は，細胞内での種々の化学反応によって支えられていることから，これらの化学反応に着目した細胞活性の評価について検討した。細菌分散液での電気化学計測において，好気下では溶存酸素の減少量から細胞の呼吸活性が評価可能であった。しかし，酸素とメナジオン（電子メディエータ）が共存した場合，電流応答が重複し，正確な活性計測が困難であった。そこで，電子メディエータについて再度探索することとした。 各種金属ナノ粒子，および高分子複合構造体を開発した。金属ナノ粒子は，金属塩を有機酸などの還元剤によって還元する化学還元法によって得た。高分子複合構造体は，各種金属塩とモノマーからなる混合溶液において，金属イオンがモノマーによって還元され，ナノ粒子を形成する反応と，モノマーが金属イオンによって酸化され，重合する反応が同時に進行する反応系によって形成された。これらのナノ構造体に，レセプターを導入した。その際，構造体表面を共有結合によって化学修飾する必要があったため，それらについて詳細に検討した。抗体導入した構造体を標識として標的細菌への結合性について評価した。構造体で標識した細胞の顕微鏡観察によって抗体修飾粒子の特異結合性を確認した。構造体で標識した細胞を暗視野顕微鏡で観察すると構造体の金属種によって異なる光散乱特性が得られ，構造体と抗体の組み合わせによって菌種の識別が可能となった。また，構想体の凝集によって散乱強度が大きく増大し，暗視野顕微鏡下における観察が容易になった。そこで，当初計画にはなかった，光散乱に基づく細菌検出法の開発についても今後検討を行うこととした。 酸素とメナジオン（電子メディエータ）が共存した場合，電流応答が重複し，正確な活性計測が困難であった。そこで，測定溶液を十分に脱気して溶存酸素を除去する操作を行ったが，完全に除去することは困難であった。また，溶存酸素の欠乏によって，細菌細胞の活性に影響を与えることが予測された。そこで，電子メディエータについて再度探索することとした。また，電子メディエータの選定において，細菌細胞の活性への影響についても十分な検討を行う必要があることが明らかになった。 構造体で標識した細胞を暗視野顕微鏡で観察すると構造体の金属種によって異なる光散乱特性が得られ，構造体と抗体の組み合わせによって菌種の識別が可能となった。そこで，当初計画にはなかった，光散乱に基づく細菌検出法の開発についても今後検討を行うこととした。 酸素とメナジオン（電子メディエータ）が共存した場合，電流応答が重複し，正確な活性計測が困難であったため，溶存酸素の除去について追加検討することとし，電子メディエータについて再度探索することとした。

安心・安全な薬物療法を実施するためには、血中の薬物濃度と薬の効果や副作用を観察しながら投薬量をコントロールする必要がある。しかしながら、現在、多くの処方薬において臨床の現場で簡単、迅速に測定できる装置が存在せず、治療薬物モニタリングが困難な状況である。以上を踏まえ、本研究では、極微量の血液から薬の濃度を「その場で瞬時に」測定するハンディシステムの創出を目指している。 本年度は、利尿薬トリアムテレン、抗がん剤であるドキソルビシンや分子標的薬パゾパニブを測定象薬物とし、それらをダイヤモンド電極センサにて感度良く計測するため、最適なサンプルの前処理方法や電気化学測定法を探索した。さらに、これらの薬を尿中や血漿中に溶解したサンプルを作成し、測定可能であるか検証した。 検討の結果、これらの薬物を含む血液や尿サンプル測定前の処理方法として、除タンパク処理液、遠心分離法の最適化を通して、サンプル採取から測定完了までの時間は、8分以内と短時間を実現した。 また、センサの薬物選択特異性を付加するために、ドキソルビシンの分子鋳型を作成した。作成した分子鋳型は、pH7.4条件下で、ドキソルビシンに対して特異的に吸着することを確認した。さらにこの分子鋳型は、特定条件にて吸着したドキソルビシンを分子鋳型から排出する。また、放出後は再度ドキソルビシンを吸着可能である。これにより、本分子鋳型は繰り返しの使用の可能性を示した。

本研究では、ダイヤモンドセンサを用いてDOAC血中濃度を迅速かつ簡便に定量する方法を確立し、抗凝固活性と効果や副作用など臨床症状との関連を検討する。最初に定量方法の評価として、①動物を用いてDOAC測定法を最適化し、検査技術を評価する。次に、②ヒト血液やDOACを経口投与した動物を用いて測定法を検証し、迅速かつ簡便な測定法を確立する。最後に、③投薬患者の血漿中濃度を計測し、LC-MS/MSによる計測値と比較することで定量性を検証する。さらに、④これらのデータと抗凝固活性、および臨床症状との関連性を評価する。そして将来、DOACの有効かつ安全なテーラーメイド治療の発展に寄与するものである。

本研究では、実験と計算科学を駆使し、内リンパ液高電位を支える血管条外層の電位(+5 mV)の維持機構の解明を目的とした。 まず、数理モデルによる外層基底側膜の輸送分子阻害時の表現型の予測現行のモデル上で、外層基底側膜に設定しているK+取込み輸送体(Na+,K+-ATPase・NKCC)の活性を10%に低下させると、K+循環がこの場所で障害されることで外層内のK+濃度が減少し、頂上膜のK+拡散電位およびISの電位の低下を介して内リンパ液高電位も大きく減少した。加えて、K+取込み輸送体を様々な度合いで阻害した場合や、Na+,K+-ATPaseとNKCCの一方を阻害した場合などモデルを用いて検討した。しかし、外層基底側膜のNa+,K+-ATPaseとNKCCを含めた数理モデルでは、膜電位の変化が再現できなかった。そのため、再度電気生理学的手法を用いて検証を行った。 申請者のグループは、in vivo実験系で薬物を用いた電気生理学的手法により、外層基底側膜に発現するNa+,K+-ATPaseの寄与について研究を行い、内リンパ液高電位とK+循環への寄与を明らかにした。具体的には、Na+,K+-ATPaseの阻害薬であるウアバインを投与し、外層基底側膜のK+濃度が低下することを確認できた。さらに、同部位におけるNKCCの役割を、NKCC選択的阻害薬を用いて検証した。その結果、外層基底側膜のK+濃度は、阻害薬の投与後も低下を認めず、これまでK+循環や内リンパ電位に関係すると考えられて来たNKCCが、実際には殆ど寄与していないことが実験により明らかとなった。 今後、この結果を元に数理モデルの改変を行い、更にこの現象を考察する予定である。 翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。 翌年度、交付申請を辞退するため、記入しない。

内耳蝸牛を満たす「内リンパ液」は、常に+80 mVの高電位を示し、内リンパ液高電位が失われると難聴が惹起される。この高電位は、内・外2層の上皮層から成る「血管条」の電位とイオン濃度動態に依存する。本研究によって、血管条イオン動態に関連する、104個のイオン輸送分子を同定した。さらに、生理実験及び、コンピュータ・シミュレーション解析の結果より、この高電位維持には、外層のナトリウムイオン輸送機構が重要である事が明らかとなった。

本年度は、ダイヤモンドセンサを用いて、分子標的薬パゾパニブ血漿中濃度測定法の開発を実施した。分子標的薬パゾパニブは、腎細胞癌および悪性軟部腫瘍の治療薬である。この薬物において、治療薬物モニタリング(TDM：Therapeutic Drug Monitoring)の実施の有効性は不確定であるが、近年TDM実施の有効性の検証が進められている。本研究では、基盤となる方法を、従来の素材より安定した反応を示すダイヤモンド電極センサを介した電気化学的アプローチにより創出した。ここでは、採取したモルモットおよびラット血漿に濃度の異なる分子標的薬を単独で添加し、測定法を検証した。手順として、除タンパクのために、薬を含む血漿サンプル100 μlに対しアセトニトリルを添加し、それを20,000 Gで2分間遠心した。そして、サンプル上清100 μlをダイヤモンドセンサに反応させた。その結果、パゾパニブの臨床濃度域に対応しうる 0.3~300 μMの範囲を定量した。測定自体は約35秒の短時間で可能であり、サンプル処理を含めても10分以内で全工程が完了した。本計測法を応用すれば、分子標的薬によるテーラーメイド治療が可能になると期待される。 概ね順調に進んでいる。しかしながら、センサ特異性の検証実験が、不十分である。また、実際にラットへ経口投与し、その動物から得た血漿中の濃度定量実験を実施している途中である。コロナ感染症の影響で、動物実験結果の検証が、実施できていない状況にある。 センサ特異性の検証実験をすすめ、測定方法のさらなる改良・最適化を進める予定である。さらに、市販のヒト血液を用いた実験や、動物実験を介して、測定方法の性能検証を実施する予定である。

鬱病、統合失調症、てんかんなどの神経精神疾患の治療の軸は薬物であるが、重い副作用が生じることが少なくない。また、薬効と副作用が個人で顕著に異なる。従って、医療現場では患者毎へのきめ細かい投薬に配慮しているが、その効果は限局的である。脳での薬物反応と、血中濃度との相関が十分に把握されていないのが要因である。そこで本研究では、針状ダイヤモンドセンサを駆使し、覚醒動物から、脳の局所薬物濃度、神経活動、血中濃度、全身症状の全てを、同時かつ長期間に渡り、リアルタイム計測するマルチ・センサシステムを創製する。加えて、薬物作用数理モデルを開発する。これらにより、薬効や毒性の発現機構の理解を深化させる。

現在，血漿サンプル量: ~100 µL，測定時間: ~35秒，簡単なボタン操作のみで測定可能な系を確立した．今後，動物血漿検体を用い，迅速性，簡便性，測定感度のさらなる向上を目指し，電極装置，サンプル処理法などの最適化を進める． また，実臨床で薬剤を服用予定の患者に，文書による同意を得た上で採血を行い，本手法による血中薬物濃度測定が可能であるか，測定結果が妥当であるか，検証を行う．