共同研究・競争的資金等の研究課題

1.Bacillus cereusのスフィンゴミエリナーゼの一次構造と活性の相関の解析。部位特異的変異によりアミノ酸を1個だけ別のアミノ酸に置換する手法で、このホスホリパーゼの一次構造のうち、4アスパラギン酸残基をグリシンに、2ヒスチジン残基をアラニンにそれぞれ変換した6箇の変異体酵素をつくり、それぞれの酵素活性と溶血活性を測定した。本酵素と牛膵デオキシリボヌクレアーゼIとの構造上の相同性が判明したので、比較参照して解析した結果、151位,296位のヒスチジン、295位のアスパラギン酸は酵素の触媒活性および溶血活性に必須で、233位のアスパラギン酸は296位ヒスチジンと水素結合して酵素活性に影響を与え、126位および156位のアスパラギン酸は基質の認識に関与していることが明らかとなった。 2.真菌Penicillium notatumのホスホリパーゼBのGPIアンカー蛋白質としての構造特異性および遺伝子の発現。本酵素の遺伝子を大腸菌にトランスフェクトして、不活性型の蛋白質として発現させることに成功した。一方、本酵素がC末端に疎水性ペプチド領域を持ち、分子内にイノシトールを含むGPIアンカー蛋白質であることを見出し、かつ本酵素が菌のプロトプラストの膜表面から自己触媒的分解により遊離されてくることを証明した。 3.Bacillus thuringiensisのホスファチジルイノシトール特異的ホスホリパーゼC(PIPLC)の大量生産系の構築。Bacillus brevisのホストーベクター系を用い、本酵素の遺伝子を発現させて、大量に酵素を産生させ、構造-活性相関の研究を行うのに充分な素地をつくった。収量はもとのB thuringiensisの培養に比べ、薬500倍となった。

本研究は,免疫担当細胞などの生体にとって重要な細胞種を含む血液細胞について,薬物代謝酵素の発現様式とその生理的機能を明らかにすることを目的とした.6種のヒト血球系培養細胞について,cytochrome P450(P450,CYP)および抱合酵素の発現解析を行った.CYPについては,CYP1A1,1A2,1B1,2A6,2A7,2D6,2E1の発現がすべての細胞で確認された.また,2A13,2C9は検出されなかった.肝臓で強く発現しているCYP3Aサブファミリーについては,CYP3A4,3A5の発現がMOLT4,K562で見られた.また、CYP3A7の発現はK562で弱い発現が認められたのみであった。さらに、HL-60やK562の分化を誘導した場合,発現しているCYPの種類、量には大きな変化は見られなかったが,K562をヘミンで誘導した際,CYP3A7の発現に若干の減少が見られた.硫酸転移酵素(SULT)については,フェノール性基質を抱合するP-ST(SULT1A1,1A3)の発現がすべての細胞で確認された.また,発癌物質の代謝的活性化に関与すると考えられるSULT1C2の強い発現も全ての細胞で観察された.しかし、甲状腺ホルモンなどを抱合するSULT1B1はU937およびJurkatで発現し、ステロイドホルモンを抱合するSULT2A1はK562でのみ発現が認められた。グルクロン酸転移酵素(UGT)では,多くの薬物・異物の抱合に関係するUGT1Aファミリーの発現はリンパ球系のMOLT4,BALL-1でのみで見られた.BALL-1では8種のUGT1Aサブタイプが発現し,MOLT4では2種のUGT1Aサブタイプの発現が見られた.ステロイドの抱合を行うUGT2Bファミリーの発現はほとんどの細胞種で見られたが,UGT2B10は4種のリンパ球系細胞のみに,また,UGT2B17はK562細胞にのみ発現していた.また,グルタチオンS-転移酵素(GST)の発現に関しては,GSTA4,GSTP1,GSTT1の発現がすべての細胞種で確認されたが,タバコの発癌物質の解毒に関係するGSTM1の発現はMOLT4にのみ発現が見られた.過酸化水素水(100μM)による過酸化ストレスの影響をK562細胞で見たところ,CYP3A4で7倍,GSTP1で10倍の発現の増加が観察された.また,MOLT4について肝臓の薬物代謝酵素を誘導する化学物質の影響を見たところ,β-ナフトフラボンや3-メチルコラントレンによりCYP1A1の発現が3〜4倍増加し,フェノバルビタールによりCYP3A4の発現が抑制され,また,UGT2B4の発現は5倍上昇した.

習慣的なコーヒー摂取が、肥満や炎症に関連して生じる生活習慣病の発症リスクを低下させる可能性が報告されている。我々は、前駆脂肪細胞3T3-L1を用いて、コーヒー豆焙煎成分がインスリンシグナル経路のアダプター分子IRS1の分解を促進することにより、肥満の要因である脂肪細胞の分化を抑制することを見出した。また、コーヒーの抗炎症効果に関して、コーヒー豆焙煎成分がＬＰＳ誘発マウスマクロファージ細胞の炎症反応を抑制することを見出し、その効果は、Keap1の不活性化による転写因子Nrf2の活性化によることを見出した。以上の結果は、コーヒーの喫飲による生活習慣病予防効果の分子論的解明につながる。

コーヒーの焙煎成分が、ヒト消化管モデルCaco-2細胞におけるエストロゲンの硫酸抱合反応を強く阻害することを見出し、この阻害活性がコーヒー摂取の習慣による生活習慣病予防効果と相関があるのではないかという仮説を立てた。デカフェインスタントコーヒー1kgより、その阻害成分の分離・同定を行ったところ、分子量205(C_<11> H_<11> NO_3)の新規含窒素芳香族化合物であった。また、コーヒー成分が、Caco-2細胞におけるエストロゲン代謝に関わる酵素群(SULT1E1, sulfatase, BCRP)の遺伝子発現に影響を与えることを見出し、そのメカニズムを解析した。

1日3-4杯のコーヒー摂取は生活習慣病を予防する効果があることが報告されている。一方、ストレスホルモンや性ホルモンなどのステロイドホルモンの代謝異常は生活習慣病のリスク要因である。そこで、ヒト由来培養細胞を用いてコーヒーの影響を解析した。その結果、コーヒーは大腸がん細胞においてはエストロゲンの活性化、乳がん細胞においては不活性化に寄与する効果を示した。これらは、共にそれぞれのがん細胞の発症を抑制する効果を期待させる。一方、前立腺がん細胞では、男性ホルモンの活性化の傾向が見られ、予防効果との相関はなかった。また、神経系細胞では認知症予防効果が期待される神経ステロイドの産生を増加する効果を示した。