共同研究・競争的資金等の研究課題

細胞内シグナル伝達に関与する膜結合タンパク質の多くは，膜に結合するためのリン脂質結合ドメインを含むいくつかの構造ドメインを有しているが，細胞膜上におけるそれらマルチ構造ドメインの挙動および脂質分子認識機構，タンパク質間相互作用は不明な点が多い．本研究ではマルチスケール分子動力学シミュレーションを行い，生体膜上での膜結合タンパク質の挙動や脂質認識，タンパク質同士の相互作用について分子レベルで研究を行う． 細胞内シグナル伝達に関与する膜結合タンパク質の多くは，膜に結合するためのリン脂質結合ドメインを含むいくつかの構造ドメインを有しているが，細胞膜上におけるそれらマルチ構造ドメインの挙動および脂質分子認識機構，タンパク質間相互作用は不明な点が多い．本研究ではマルチスケール分子動力学シミュレーションを行い，生体膜上での膜結合タンパク質の挙動や脂質認識，タンパク質同士の相互作用について分子レベルで明らかにすることを目的としている． 今年度は，AlphaFold によって推定したBtkタンパク質の全長立体構造モデルを使用し，タンパク質／水／イオン系の粗視化モデルを用いた分子動力学計算を行った．粗視化モデルとして使用したMartiniモデルは，タンパク質同士の相互作用が強すぎることが知られているため，タンパク質の大きさを表す慣性半径が実験値を再現するよう，粗視化モデルの相互作用パラメータの調整を行った．次に調整した相互作用パラメータを用いて，タンパク質／生体膜／水／イオン系の粗視化分子動力学計算を行った．シグナル伝達に関与する脂質分子であるホスホイノシタイドの1種（PIP3）が数%含まれるPOPC／POPS膜を使用し，タンパク質とPIP3の相互作用を解析した． また，粗視化分子動力学計算よりも大きな時空間スケールでの不均一な生体膜上でのタンパク質挙動を可視化するためのメゾスケールシミュレーション手法の開発を行った．飽和脂肪酸と不飽和脂肪酸の脂質分子の混在により秩序液体相 （Lo相）と無秩序液体相（Ld相）への相分離した膜において，タンパク質の結合により場の相分離が変化するモデルの開発・検討を行った 今年度計画していた研究項目について研究を実施したが，粗視化分子動力学計算に用いる力場の調整に時間がかかり，やや遅れている． 引き続き，粗視化力場の調整と計画していた生体膜上でのタンパク質挙動の詳細な解析を行うとともに，メゾスケールシミュレーションモデルの検証および改良を行いたいと考えている．

本研究では、全原子シミュレーションデータと顕微鏡観察データを統合し、ミクロな化学構造からマクロな相挙動を予測するための新たなパイプライン（膜構造システム理論）の構築を進める。複合体の物理的特徴に応じて異なる粗視化粒子モデルを採用し、全原子モデルおよび実験データに基づいて粗視化粒子（膜タンパク質）間の相互作用を導出することで、本研究領域の実験班と協力して人工膜や細胞膜における複合体形成の機構やその成立条件を明らかにすることを目指す。

本研究では，脂質膜の膜厚や張力の違いがカリウムチャネルの構造遷移やイオン透過性を変化させる現象に着目し，全原子分子動力学計算のデータを基に，単一チャネル測定と同じ時間スケールでゲート特性と電気信号特性を同時にシミュレーションできるメゾスケール計算法を開発する．実験データとの比較を通じてモデルを検証・改良することで，膜厚や張力がチャネル機能を制御する分子機構を解明し，ゲート機構とイオン透過の因果関係を直接結びつける．本アプローチにより，分子レベルの構造変化からマクロな機能出力に至る因果関係を多階層にわたって理解するための新たな指針を示す．

生体膜では，脂質やタンパク質が凝集した動的かつ不均一なドメインが形成される．本研究では，動的不均一場におけるタンパク質のクラスター化現象の解明を目指し，反応拡散方程式とブラウン動力学法を組み合わせたメゾスケールシミュレーション法を確立する．反応拡散方程式では，膜内で形成されるドメイン混在状態の時間変化挙動を，ブラウン動力学では不均一場を拡散するタンパク質挙動をモデル化する．

近年，細胞内の液－液相分離現象によって，RNAと天然変性タンパク質が膜を有さない構造体（非膜性構造体）を形成することが明らかになってきている．非膜性構造体を形成する天然変性タンパク質は，構造ドメインと柔軟に構造が変化する天然変性領域を持つものが多いことが知られているが，それらの分子間相互作用や挙動は不明である．本研究では，分子動力学シミュレーションにより，非膜性構造体内部でのタンパク質とRNAの分子間相互作用および挙動を解析し，天然変性タンパク質が有する構造ドメインおよび天然変性領域が果たす協同的役割について研究する． 細胞内の液－液相分離現象によって，RNAや天然変性タンパク質が膜を有さない構造体（非膜性構造体）を形成する．非膜性構造体を形成する天然変性タンパク質は，立体構造が安定している構造ドメインと柔軟に構造が変化する天然変性領域を持つものが多いことが知られているが，そういった構造的な特徴が非膜性構造体形成において果たす役割については，不明な点が多い．本研究では非膜性構造体の分子動力学シミュレーションを行い，非膜性構造体内部におけるタンパク質の相互作用およびダイナミクスを分子レベルで解明すること目的としている． 本年度は，天然変性領域および構造ドメイン領域を含むタンパク質（FUSやG3BP1，TDP-43など）とRNAにより形成される非膜生構造体の粗視化分子動力学シミュレーションを行った．形成された非膜生構造体内部の密度分布，分子の拡散性，分子間相互作用，構造体の形状などを解析した．タンパク質のみで非膜性構造体を形成するものと，タンパク質のみでは非膜性構造体が形成されずRNA－タンパク質相互作用が非膜性構造体の形成において重要なものを比較することで，タンパク質の種類によって非膜性構造体内部の分子分布が異なることがわかった．タンパク質の種類の違い，構造ドメインや天然変性領域の有無のシミュレーションもいくつか行うことで，構造ドメインと天然変性領域が非膜性構造体の形成メカニズムや非膜性構造体内部の物性に与える影響を分子レベルで明らかにした． 令和4年度が最終年度であるため、記入しない。 令和4年度が最終年度であるため、記入しない。

本研究課題では，マルチスケール分子動力学シミュレーション法を用いて，ホスホイノシタイド／イノシトール リン脂質（PIPs）の脂肪酸組成の違いが生体膜上における脂質―膜結合タンパク質相互作用やタンパク質のダイナミクスに与える影響について，分子レベルで解明することを目指している．初年度の研究成果を下記に述べる． （1）Btk（Bruton’s tyrosine kinase）-PH ドメイン／生体膜／イオン／水分子系の粗視化分子動力学シミュレーションを行い，PIPsの脂肪酸の違いやPIPsの膜中での濃度の違いが，タンパク質の膜上での配向に影響を与えることを明らかにした． （2）アシル基がパルミチン酸のみで構成されるPIP3（32:0）と，ステアリン酸とアラキドン酸で構成されるPIP3（38:4）の2種類について膜内での分布を解析した結果，PIP3（38:4）含有膜では，PIP3（32:0）に比べ，アシル基が膜界面近傍でPHドメインと相互作用していることがわかった． （3）レプリカ交換アンブレラサンプリング法を用いてPHドメインの生体膜への結合エネルギーを計算し，PIPsのアシル基の違いによってPHドメインと生体膜との相互作用に違いがあることが明らかになった． （4）変異体（Y142A，F146A）について全原子分子動力学シミュレーションを行った結果，タンパク質構造が変化し，ノンカノニカルサイトが維持されないことがわかった． 今年度計画していた研究項目について研究を実施し，概ね順調に進展している． 脂肪酸の組成が違うPIPsを含む生体膜とBtk-PHドメインのマルチスケール分子動力学シミュレーションを行い，PIPsの脂肪酸の違いがBtk-PHドメインと生体膜との相互作用に影響を与えることを分子レベルで明らかにすることができた． 今後は，前年度に引き続き，Btk-PHドメインとPIPsとの相互作用を分子レベルで解析するとともに， （1）PIPsの脂肪酸の違いがPHドメインの生体膜上でのダイナミクスに与える影響を，粗視化分子シミュレーションと非平衡統計力学的手法によって解析する． （2）人口脂質膜を用いた生化学実験によってBtk-PHドメインの生体膜への結合性を解析し，分子動力学シミュレーションと生化学実験を相互にフィードバックを掛け合いながら洗練し，脂質―タンパク質の新しい相互作用モードを提示する．

アクアポリン（AQP）は細胞膜に存在し，ほとんどのものが水分子を選択的に透過させる水チャネルであるが，中には水分子以外の低分子を選択的に透過させるAQPが存在する．しかし，これら低分子を透過させる哺乳類のAQPについては実験による結晶構造が得られていないため，AQPの低分子透過メカニズムの分子レベルでの解明は行われていない．本研究では，タンパク質立体構造予測法と分子動力学シミュレーション法を用い，アミノ酸変位によってアニオン・水分子透過性が切り替わるAQP6のアニオン・水分子透過メカニズムの分子レベルでの解明を目指している． 初年度の研究成果を下記に述べる． （1）立体構造予測法を用いて予測したアクアポリンの立体構造を用いて，アクアポリン／脂質膜／水／イオンの系に対して温度圧力一定条件において長時間（1～2マイクロ秒）の分子動力学シミュレーションを行った．野生型AQP6とアミノ酸変位型AQP6（N63G）を用い，それぞれ中性・酸性条件下において計4種類の計算を行った． （2）構造予測モデルの妥当性を検証するために，タンパク質の脂質膜内での構造安定性を解析し，シミュレーション時間内では脂質膜内においてAQPの立体構造が安定していることがわかった．さらに，野生型のAQP3とAQP8についてもシミュレーションを行い，AQPの立体構造モデルの妥当性を検証した． （3）AQPの細孔内を水分子が透過することがわかった．さらに，野生型AQP6に関して酸性条件において細孔内にアニオンが入ることを確認した． 今年度計画していた研究項目について研究を実施し，概ね順調に進展している． 立体構造予測したAQP3, AQP6, AQP8を用いた分子動力学シミュレーションでは，脂質膜内でのAQP立体構造が安定して存在していることに加え，水分子が細孔内を透過しているため，他のAQP結晶構造を用いた分子動力学シミュレーションで観測される現象と同様のものが観測されている． さらに，酸性条件において野生型AQP6の細孔内にアニオンが入ることを確認しており，次年度でのイオン濃度勾配下におけるアニオン透過の分子レベルでの観測に可能性を見出している． 今後は， （1）平成30年度に引き続きアクアポリンの水・イオン透過性について解析する． （2）イオン濃度勾配下におけるAQP6のアニオン透過性について解析する．通常，分子シミュレーションでは周期境界条件を使用しているため，上下，左右の境界が繋がっている．計算系においてイオンの濃度勾配を生じさせるために，細胞膜を2枚設置し，イオン濃度が2枚の膜で挟まれた中心部分（溶液A）と外側部分（溶液B）で異なる系について分子動力学シミュレーションを行う．濃度勾配を一定に保つために，イオンが溶液AB間をAQPを透過して移動した場合，移動したイオンを確率的に別の溶液の水分子と入れ替え，イオンの濃度勾配を一定に保つ． （3）分子選択性に寄与しているサイトを明らかにするために，イオンがAQP6の細孔内を通過する際の平均力ポテンシャルを傘サンプル法を用いて計算する．