共同研究・競争的資金等の研究課題

細菌叢と疾患の関連において、細菌由来細胞外小胞に含まれるRNAの機能研究は未開拓である。応募者は、細菌RNAがマクロファージを変容させ肝発がんに寄与することを実証した。本研究では、細菌RNAによる宿主細胞撹乱と発がんの分子機序を包括的に解明し、細菌・宿主・がんの関係に新機軸を構築する。これにより発がん機構の理解を拡張し、革新的な予防・治療戦略の創出を目指す。

膵がんのように早期診断技術開発が待望される腫瘍において、血中マイクロRNA (miRNA)診断の実用化が期待されている。多くの臨床検体の解析から、そのコンセプトの正しさは実証されているが、血中miRNAによってなぜ膵がんが診断できるのか証明しきれていない。特に膵腫瘍の発生によって周辺の細胞や免疫細胞などが反応し、分泌するmiRNAが変化することも、血中miRNAに大きく影響している可能性がある。本研究はこれらの点を考慮し、マウスで膵発がん過程での血中miRNA変化を追跡し、その生理学的意義を明らかにすることで、実臨床における血中miRNA診断実用化に必須となる基盤的知見を提供する。

本研究は、初代分離培養した膵外分泌細胞に対して低分子化合物を曝露させ、in vitroでパーシャルリプログラミングを行って膵前駆細胞を樹立し、この細胞に胆汁酸によるストレス刺激を与えることで膵発がん初期の環境をin vitroでモデル化し、膵発がん超初期のバイオマーカーとなるmicroRNAの同定を試みるものである。我々はラットおよびマウスの膵外分泌細胞を用いて、特定の低分子化合物のコンビネーションが膵前駆細胞を誘導することを見出したが、一方で誘導された膵前駆細胞の性能を、Pdx1やNkx6.1といったマーカー分子で評価したところ、実験ロットによって均質でないことを見出した。そこでsingle cell sortingによって、膵前駆細胞としてより機能的に優れた細胞のクローン化を試み、これに成功した。驚くべきことに、この膵前駆細胞は特定の培養環境下においてインスリンを分泌する細胞にも分化し得た。また膵外分泌細胞よりDBAレクチンを用いて分取した膵管上皮細胞が膵前駆細胞の由来細胞であることも見出した。 機能的に優れた膵前駆細胞のクローニングに成功した。この細胞に胆汁酸を曝露した際に濃度依存的に変動する細胞内/細胞外マイクロRNAのマイクロアレイ解析も完了し、データ解析を進めている。 胆汁酸曝露により変動するマイクロRNA候補を同定し、すでに完成しているヒト血清マイクロRNAデータベースと照合することにより、膵がん早期診断マーカーとしてのポテンシャルに優れたマイクロRNAを絞り込む。胆汁酸曝露によるマイクロRNA発現調節機序を解析する。

大規模ながんに対する次世代シーケンシング解析の結果から、遺伝子の変異はドライバー変異とそれによって引き起こされるゲノム不安定性の産物であるパッセンジャー変異とに選別されており、ドライバー変異は腫瘍形成に直接関与すると推定されている。しかし、そのように同定された新規ドライバー候補の多くは綿密な機能解析は行われておらず実際はどの程度、腫瘍形成に寄与するのかは不明なのが現状である。また、単独ではなく複数の変異の組合せによって発がん作用を発揮する可能性もあり、これもドライバー変異の包括的な機能解析を阻んでいる要因とされる。本研究では、申請者らが独自に開発した培養可能な上皮幹細胞を用いて、CRISPR/Cas9を使用し遺伝子の欠損を導入する。それによって、既知のがん抑制遺伝子だけでなく、統計的に有意にがんの発生に関与していることが明らかなものの、その発がん過程での寄与率が不明瞭な遺伝子の機能解析を組織ごとにすることで、新規がん抑制遺伝子の機能的な同定をすることさらに、それらの組合せによって多段階的に進展していく発がん過程を再現することを目的としている。 ドライバー変異の機能解析結果からがん腫瘍形成に関与している因子の絞り込みを行い、申請者はそれらの組合せによってがんを誘導する遺伝子欠損の組合せの決定を実施中である。実施が比較的容易な遺伝子の欠損を起こすことで、表現型が確認される遺伝子変異に注目して実験を行っている。計画段階で選択した遺伝子の解析だけでなく、他組織に対する遺伝子にも標的を広げ、CRISPR-Cas9を用いた遺伝子抑制実験を実施している。さらに遺伝子欠損の組合せによる多段階発がんの実験も同時並行で行っている。 当初予定していた、肝臓がんに対する遺伝子だけでなく、より顕著な表現型を確認することができる肺の上皮細胞を用いた検討にも着手しており、そちらの検討でより良好な結果が得られたため、CRISPR-Cas9を用いてがん抑制遺伝子を抑制し、肺の腺がん細胞の源と考えられている小気道上皮細胞、および肺の扁平上皮がんの元と考えられている肺の気管上皮細胞に対して、CRISPR-Cas9で遺伝子の抑制を行うことで、細胞ごとのがん抑制遺伝子の差や発がんへの寄与率を比較検討することが可能になり、より多くの情報を得ることが可能になると期待されたため、そちらの検討も行っている。これらの実験で、同時にがんの元となる細胞の再検証も可能になり、多段階発がんに関与する遺伝子の組合せの同定も同時に進めている。そのため、当初の予定よりもやや遅れている。しかしながら、それらの実験結果は当初予定していたものよりも、重要かつ多くの発がんに対する知見を得られることが強く期待でき、そちらに方向転換することに大きな意義があると申請者は考えている。 対象とする細胞の種類を増やしたことによって、CRISPR-Cas9で抑制する遺伝子群は変更になったが、研究の手技的には大きな変化はない。細胞ごとに遺伝子を抑制していき、細胞の増殖率の変化を検証すること、さらには組合せによって、発がんに実質的に寄与する遺伝子およびその組合せの探索を細胞ごとに進めていく。細胞が発がんに至るまでの遺伝子変異の組合せを同定することで、それらを段階的に導入し、多段階的な発がん過程を再現すること、ならびに細胞が浸潤能や転移能を有する上での必須な遺伝子の組合せを網羅的に同定することで、これまでの大規模ながんゲノム解析データから得られた情報を実験的に検証していく。

欧米で急増している食道腺がんは、胆汁酸の食道内への逆流が主要因である。また中心性肥満は食道腺がんの主要なリスク因子である。一般に中心性肥満の進行に伴い血中アディポネクチンが低下する。一方、我々は胆汁酸刺激が核内胆汁酸受容体FXRの活性化およびmiR-221/222の亢進を介して発がん促進に寄与することを報告していたが、今回さらにmiR-221/222がCOX-2発現を増加させることを見出した。更にアディポネクチンはこのCOX-2上昇を是正する作用があるがわかった。この結果は、中心性肥満を有する食道腺がんハイリスク症例にはアディポネクチン受容体作動薬による化学予防が有効である可能性を示唆した。

本研究では，ラット・マウスの成熟肝細胞を前駆細胞へとリプログラミングできることを確かめている低分子化合物を用いて，ヒト肝細胞も同様にリプログラミングできるかどうか，またそのようにして得られた肝前駆細胞(ヒトCLiP)が，肝臓再生に寄与しうるかどうかを検討することを目的とした．主な成果は以下の通りとなる.（１）乳幼児肝細胞からヒトCLiPを誘導できた．（２）ヒトCLiPから分化誘導した肝細胞はCYP活性を示した．（３）ヒトCLiPは慢性肝疾患モデルマウスの肝臓を高効率に置換し，移植後のキメラ肝臓から取り出したヒト肝細胞は初代成熟肝細胞と同等レベルの代謝能を示した．