共同研究・競争的資金等の研究課題

既にDZNepおよびEzh2コンディショナルノックアウト(cKO)マウスを用いて、エラスターゼ誘導肺気腫モデルで気腫が増悪する結果を得ている。Ezh2 cKOマウスを用いたエラスターゼ誘導肺気腫モデルにおいて、投与7日後の全肺細胞をFACSで解析したところ、NK細胞お よびCD11b陽性マクロファージがEzh2 cKOマウス群でEzh2 cKO群で有意に上昇していた。同様に、DZNepを用いたエラスターゼ誘導肺気 腫モデルにおいてもNK細胞およびCD11b陽性マクロファージがDZNep投与群で有意に上昇していることを確認した。また、CD11b陽性細胞もしくはNK細胞に対するアンタゴニストを用いた実験ではDZNep投与による気腫増悪が相殺された。また、Ezh2 cKOマウスを用いて長期喫煙曝露モデルで検討した。喫煙開始12週間後の肺組織において、Ezh2 cKOマウス群で有意に気腫が増悪した。また、FACSではNK細胞およびCD11b陽性マクロファージが上昇していることを確認した。さらにEzh2 cKOマウスにおいて、タモキシフェン誘導性にEzh2をノックアウトし6ヶ月の長期観察を行ったところ、一部のマウスに腫瘍発生がみられることを確認した。また、肺組織を固定したところ、気腫形成がコントロール群に比較して増悪した可能性が示唆された。今後さらに、Ezh2 cKOマウス群での気腫増悪の機序およびヒト肺組織における検討を行う予定である。

肺非結核性抗酸菌(NTM)症は難治性の慢性進行性呼吸器感染症であり、抗菌薬治療における効果は限られ、新たな治療戦略が求められる。申請者のグループは、肺NTM症の患者情報・臨床検体を含むデータベースを構築し、解析・報告する中で、同疾患に特徴的な気管支拡張病変に着目した。本研究では、申請者らが集積した喀痰などの臨床検体を用いて、 国際共同研究先あるノースカロライナ大学(UNC)が独自に有する系により、ムチンおよび生物物理学的特徴を解析する。申請者は肺NTM症・気管支拡張症の病理検体を用いて、主座が末梢気道病変にあり、ムチン異常集積が重要であることを明らかにした。慶應義塾大学病院で倫理委員会で承認を得て集積した検体は200例以上となり、その一部をノースカロライナ大学に搬送し、解析のための検体準備を進めた。また同時に、患者における臨床情報を集積し、さらなる分子生物学的解析を施行するための病理組織および気道上皮細胞を集積している。2022年度には現地に渡航し、サンプルの整理およびセミナーを含めた討議を行った。さらに、日本における気道上皮細胞培養体制を構築することができた。健常者由来の喀痰検体も集積し、既に現地に搬送した。2023年度では各種検体の解析を遂行する予定である。

共同研究で実施している肺非結核性抗酸菌(NTM)症に関するゲノムワイド関連解析において候補SNPおよび疾患感受性遺伝子Xが同定された。肺NTM症の疾患感受性遺伝子Xが恒常的に検出されていることがデータベースで確認されている、ヒト上皮細胞株H292細胞株に対して、Mycobacterium avium subsp. Hominissuis (MAH)104株を感染させ、菌の細胞内への取り込みおよびその後の細胞内増殖の変化、疾患感受性遺伝子Xの変動を経時的に確認した。菌に関しては培養およびチールニールゼン染色で評価した。その後同様の実験をsiRNAによるknockdown(KD)、プラスミドによるoverexpression(OE)を試み施行した。それぞれの遺伝子のKDおよびOEは確認したものの、菌量および遺伝子発現の明確な差は検出できなかった。同様の実験をヒト気道上皮株であるBEAS2Bで施行したが、同様に明確な差が得られなかった。ヒト末梢血単核球細胞(PBMC)に対する経時的な感染実験においても候補遺伝子をいくつか検討したが、明確な上昇を得ることはできなかった。その後、Primary Human Bronchial Epithelial Cellsの培養系において遺伝子Xの発現を確認し、電気穿孔法を用いたCRISPR-Cas9およびgRNAの導入により遺伝子Xのノックアウト株の樹立に成功した。今後、気相液相界面培養(ALI)による分化後の変化を検討する予定である。また、同細胞の培養系において、レンチウイルスを用いた過剰発現の系も実施予定である。また、肺組織において同遺伝子の発現局在を確認した。今後は疾患肺との比較を行う予定である。

慢性閉塞性肺疾患（COPD）は現在世界第4位の死因で重篤な疾患であるが、根本的な治療は存在しない。近年COPDではヒストンアセチル化を中心にエピジェネティクスによる遺伝子発現制御の重要性が報告されたが、ヒストンアセチル化とクロストークするヒストンメチル化を介する制御の関与は明らかではない。本研究ではCOPDの病態形成・進行におけるEzh2を介するエピジェネティクス制御機構の関与を検討することを目的とした。 エラスターゼ誘導肺気腫モデルマウスを用いて、Ezh2阻害薬DZNepを投与し、気腫肺の比率(Low Attenuation Area: LAA%) (micro CTによる測定)、病理像、肺胞洗浄液中の細胞数・細胞分画・各種サイトカイン発現量、全肺における各種免疫担当細胞の表面マーカーの発現を検討した。DZNep投与群で対照群に比べ、エラスターゼ投与28日後のLAA%、Lmが有意に増加した。気管支肺胞洗浄液ではDZNep投与群で早期に好中球、後期にマクロファージの上昇がみられ、炎症性サイトカインが上昇していた。エラスターゼ投与7日後のFACSではBリンパ球、CD4陽性リンパ球、NK細胞がDZNep群で有意に増加した。また、DZNep群においてCD206陽性マクロファージの減少、CD11b陽性Ly6C高発現細胞すなわち炎症性単球の増加がみられた。 今後炎症性単球やM1/M2のマクロファージ分化におけるEzh2の役割に着目し、更なる解析を進める。また、Ezh2コンディショナルノックアウトマウスを用いたエラスターゼ誘導肺気腫モデル、長期喫煙モデルの検討も行う予定である。