共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究では、難治性脳腫瘍に対するペプチドワクチン療法臨床試験被験者の様々な検体を用いて個々の患者における正・負の免疫動態を総合的に評価し、①同ペプチドワクチン療法の効果が期待できる症例の選出方法開発（免疫療法の有効性を予測するための免疫バイオマーカー探索）、②免疫バイオマーカーにより同免疫療法と抗がん剤との組み合わせなどの免疫制御法の改良技術を評価する。本研究成果は、本治療に対する治療反応性予測を可能にし、治療成績向上につながる可能性がある。また、脳腫瘍免疫および脳腫瘍血管新生・浸潤性における新たな機構の解明につながり、治療困難な脳腫瘍の治療成績の改善に貢献することが期待される。

悪性神経膠腫（グリオーマ）は、グリオーマ幹細胞（GSC）の存在により、強い浸潤性お よび治療抵抗性を示す。本研究では、治療抵抗性・浸潤性GCSに追従するiPS細胞由来神経 幹細胞を、自殺遺伝子搭載複製型ウイルスの”producing cell” かつ“delivery vehicle”として用いる革新的な新規治療法を開発する。

本研究では、申請者らが併行して実施している悪性神経膠腫および腫瘍新生血管に対するペプチドワクチン療法臨床試験（計3試験）被験者検体を用いて、免疫応答関連細胞・因子、また脳腫瘍血管新生および浸潤性関連因子について解析し、臨床的有効性との関連性を検証した。その結果、同ワクチン療法による臨床的有効性を認めた患者検体では、ワクチン療法後にVEGFR発現細胞反応性細胞傷害性T細胞の高頻度検出、血清中のsVEGFR2値の低下、血漿中のIL-8値の低下を認めており、これらは同ワクチン療法バイオマーカーとして治療効果評価や治療反応性予測に応用しうると考えられた。

本研究では、脳腫瘍幹細胞(BCSC)における幹細胞制御分子の同定を目的として、分離BCSCを用いた網羅的な遺伝子発現比較解析を行った結果、新 規 のBCSC抗原KLRC2を同定した。さらに幹細胞制御分子スクリーニング解析を行った結果、BCSC増殖制御分子MIFを同定した。KLRC2およびMIF は、ともに正常脳組織で発現を認めず、一方、BCSCおよびグリオーマ において高発現しており、BCSCマーカーとして、さらにグリオーマ治療標的分子としてその有用性が期待される。

本研究では、グリオーマ細胞、脳腫瘍幹細胞、およびグリオーマ組織において、免疫抑制性のVEGF/VEGFR系が高発現していることを明らかにした。また、再発悪性神経膠腫8症例に対してVEGFR1/2ペプチドワクチン療法を施行し、重篤な有害事象なく2例の不変（stable disease: SD）が得られた。投与前後のVEGFR特異的T細胞(CTL)の解析（6症例）を行った結果、ワクチン後にVEGFR1特異的CTLが6例中6例、VEGFR2特異的CTLが6例中2例で誘導された。以上からVEGF阻害(腫瘍免疫抑制の制御および腫瘍血管新生抑制)による新たな免疫療法の有効性が示唆された。

本研究では、申請者らが実施している悪性脳腫瘍新生血管を治療標的としたペプチドワクチン療法臨床試験被験者検体を用いて、①血管新生抑制療法に対する反応性および抵抗性を示す腫瘍血管新生・浸潤性関連因子バイオマーカーや、②抗腫瘍免疫ネットワークにおける正と負の調節細胞や分子について解析し、同治療の臨床的有効性との関連性を評価した。同ワクチン療法による臨床的有効性を認めた患者検体では、ワクチン療法後にVEGFR発現細胞反応性細胞傷害性T細胞の高頻度検出、および血清中のsVEGFR2値の低下を認めており、これらは同ワクチン療法バイオマーカーとして治療効果評価や治療反応性予測に応用しうると考えられた。

最近、悪性神経膠芽腫細胞の研究において、がん細胞がmRNAやmicroRNA(miRNA)やタンパク質を含むエクソソームを放出し、がんの進行に関わる可能性が報告された。我々は、ヒト脳腫瘍細胞で高発現している特定のmiRNAが、細胞傷害性T細胞(CTL)による細胞傷害の感受性を低下させ、抗腫瘍免疫応答における免疫効果相で免疫抵抗性をもたらすことを報告した。さらに、脳腫瘍患者血清から抽出したエクソソームはこのmiRNAを含んでおり、そのレベルは健常人血清に比較して有意に高く、血清miRNA検出による脳腫瘍診断開発の可能性が示唆された。また、このmiRNAを含有する脳腫瘍細胞由来のエクソソームは、樹状細胞に取り込まれ、樹状細胞上でも、T細胞活性化に重要な因子を低下させる可能性を見いだした。したがって、がん細胞由来エクソソームに含まれるmiRNAは、担がん生体の免疫抑制病態に関与する可能性がある。

がん免疫療法は期待されているが、まだ標準治療になっていない。本研究では、免疫療法の科学的な改良を目指して、ヒトがん抗原の同定、がん免疫応答、特に免疫抑制の機序解明、がん組織を構成するがん細胞群として、抗がん剤抵抗性で再発の原因となるがん幹細胞と転移の原因となる上皮間葉転換がん細胞の免疫特性の解明を行った。本研究で見つかったがん抗原や免疫制御法を用いた新しいがんの診断法や治療法の開発が期待される。

近年CD8陽性T細胞活性の増強や維持にはCD4陽性T細胞が重要な役割を担っていることが明らかになった。我々は、グリオーマ患者血清を用いたSEREX (serological identification of antigens by recombinant expression cloning)法により、精巣組織由来のcDNA libraryをスクリーニングしたところ、胎生期に転写調節因子として機能するSOX6を単離した。さらにSOX6は、グリオーマ組織において高い発現を示し、グリオーマ患者血清中IgG抗体に高頻度に認識されることから、SOX6が抗原特異的にCD4陽性T細胞を活性化していることが示唆された。そこで、グリオーマ担癌マウスモデルにおいて、CD8陽性T細胞に認識される抗原としてマウスグリオーマ由来新規抗原遺伝子GARC-1を、CD4陽性T細胞が認識する抗原としてSOX6を用いた腫瘍特異的免疫の活性化を試みた。GARC-1とSOX6それぞれの全長を含んだplasmid DNAをC57BL/6マウス皮内に遺伝子銃による免疫を行い、免疫マウスの脾細胞を用いて両抗原を発現しているマウス由来のグリオーマ細胞GL261をターゲットにしたIFN-γ assayを行ったところ、GARC-1とSOX6双方で免疫した群では各々単独で免疫した群やコントロール群と比してGL261に対するIFN-γ放出量の著明な増加を示した。このことから、GARC-1とSOX6双方で免疫した群ではGL261に対する特異的細胞障害性T細胞が誘導されたことが示唆された。また、最終ワクチンから2週間後に、免疫マウスの頭蓋内にGL261細胞を移植し、腫瘍の生着および増殖能を生存期間により検討したところ、GARC-1とSOX6双方で免疫した群ではコントロール群と比して有意に生存期間が延長された。 これらの結果から、CD4陽性T細胞を活性化し得るSEREX抗原SOX6とCD8陽性T細胞に認識されるグリオーマ抗原両者を用いた免疫遺伝子治療によって、グリオーマ細胞に対する特異的細胞障害性が増強され、さらに腫瘍拒絶能を向上し得ることが示された。このことから、グリオーマ抗原SOX6を用いたDNAワクチンは、グリオーマに対する免疫遺伝子治療に応用できる可能性があると考えられる。