共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究では イムノグロブリンのクラススイッチ(CSR)制御機構におけるPI3K(p85α)と、関与するサイトカインシグナルとの関係について解析を行った。その結果、lipopolysaccharide (LPS)刺激によるIgG1、IgG3へのCSRがp85αノックアウトマウス由来のB細胞において著減することを確認し、CSRに必須であるgerm line transcription (GLT)、post switch transcript (PST)の形成、およびactivation induced cytidine deaminase(AID)の発現も減少していることを確認した。一方、LPS刺激にIL-4刺激を加える事により、p85αノックアウトマウス由来のB細胞にみられるIgG1、IgG3へのCSR不全が解除される事を見出した。以上の事はPI3Kが抗体のCSRの制御に深く関与している可能性を強く示唆するものであることに加え、その反応がサイトカインシグナルなどにより可逆的に制御可能であることが強く示唆された。

抗菌ペプチドは幅広い抗菌作用を持ち、宿主に対して毒性が低く、耐性菌を生じにくいなどの特徴がある。口腔内にも多数発現し、感染防御において重要な役割を果たしている。抗菌ペプチドを用いたオーラルケアは低侵襲な方法であり、有用で安全なシステムの構築が期待できると考える。令和2年度に大腸菌を使用しない無細胞蛋白質合成系により抗菌ペプチドLipocalin 2 (LCN2）を合成、リポソーム中に封入し、口腔上皮細胞と培養することにより抗菌ペプチドの口腔上皮細胞への送達について検討を行った。しかしながら抗菌ペプチドの合成量が低いことが課題であった。令和3年度は無細胞蛋白合成系におけるLCN2合成量の改良と、合成したLCN2がPorphyromonas gingivalis (Pg)のヒト口腔上皮細胞への付着を抑制するかを検討した。 今回、アミノ酸配列は変更せず、LCN2遺伝子配列がAT richになるようなコドンを選択して鋳型DNAを再設計した。無細胞蛋白合成キットを用いて鋳型DNAからLCN2を合成し、Western blottingとELISAにより合成量を分析した。合成したLCN2はオリジナルの配列で合成したLCN2と比較して約500倍の合成量になった。また、Pg ATCC33277株を培養し、Pg菌体を蛍光色素でラベルした。 LCN2で12時間処理したヒト口腔上皮細胞(TR146)系にラベルしたPg菌を添加し、2時間後に洗浄、プレートリーダーにて付着したPg菌の蛍光強度を測定した。その結果、合成LCN2はリコンビナントLCN2と同様にTR146細胞へのPg菌の付着を抑制した。合成された抗菌ペプチドは、感染予防効果を有し、新たなオーラルケア法の開発に繋がる可能性がある。

マウス活性化CD8+T細胞が外来抗原を提示し、ナイーブCD8+T細胞を活性化することが出来るかを検証するために以下の実験を行った。 1)OVA抗原特異的なTCRトランスジェニックマウスのCD8+T細胞をOVAペプチドをパルスした樹状細胞で活性化させ、その活性化CD8+T細胞がOVA抗原特異的なTCRトランスジェニックマウスのナイーブCD8+T細胞を活性化出来るかどうかを確かめる。 昨年度、B6マウスのCD8+T細胞には恒常的にB7-2分子が発現することを確認し、さらにこの細胞を抗TCR抗体および抗CD28抗体でin vitroにおいて刺激することによってB7-2分子の発現が上昇することを確認し、さらにCD8+T細胞が活性化することによってCD8+T細胞自身のMHC class I抗原の発現とあわせると、抗原提示細胞としての要件を満たしていることを明らかにした。この結果をふまえ、抗TCR抗体および抗CD28抗体で活性化したB6マウスの活性化CD8+T細胞にOVAペプチドをパルスし、OT-IマウスのCD8+T細胞と共培養したところ、OVAの濃度が10mMの際にOT-I CD8+T細胞の増殖がみられた。この結果より、活性化CD8+T細胞に抗原提示作用がある可能性が推察されたことから、抗原特異的に活性化されたCD8+T細胞に、同一抗原であるOVAペプチドをパルスすることでナイーブCD8+T細胞を活性化させることが出来るかを検討した。その結果わずかながらナイーブCD8+T細胞を活性化する可能性が確認された。今後この抗原提示能をもつCD8+T細胞が単一集団かどうか、また通常のCD8+T細胞と比較して特徴があるかを検討する。

抗原刺激後に産生される記憶B細胞は体内において長期にわたって維持される。この記憶B細胞の産生・維持には、細胞外の環境との相互作用が必要であるとの仮定の元に、記憶B細胞で特異的に発現する細胞表面蛋白のスクリーニングを行った。まず、記憶B細胞より作製したレトロウィルスcDNAライブラリーを用いて、シグナル・シークエンス・トラップ法を用いた膜分子のスクリーニングを行った。得られた約2000のクローンについてマイクロアレイを作製し、記憶B細胞よりRNA増幅法によって調整したcDNAプローブを用いて発現解析を行い、記憶B細胞で高発現する分子を選別した。またこれとは別に同じcDNAプローブを用いて、約8600遺伝子を含むcDNAマイクロアレイによる遺伝子発現解析を行った。これらの実験から得られたクローンについてRT-PCR法による発現の観察を行ったところ、記憶B細胞で著しく発現増強する8つの遺伝子を同定した。このうちD6ケモカインレセプターは、MIP-1aなどのCCケモカインに結合する7回膜貫通型分子として知られている分子であり、この分子が記憶B細胞とともに脾臓辺縁帯B細胞、腹腔B1細胞で特異的に発現していることを見出した。これらの細胞は同じくMIP-1aに結合するCCR1も発現していることを観察したが、しかし、いずれの細胞もMIP-1aに対する遊走性を示さなかった。MIP-1aなどのCCケモカインと反応が記憶B細胞、辺縁帯B細胞の他のケモカインBLC,SDF-1に対する遊走性に変化を与えるかどうかについて現在解析を行っている。

日本人ではAP1S3は膿疱性疾患の病因でないということを明らかにした。常染色体優性遺伝の膿疱性乾癬(GPP)の家系で従来毛孔性紅色粃糠疹で報告されていたCARD14の変異を同定した。劣性遺伝のGPP家系で新規IL36RN変異を同定した。Il36rnノックアウトマウスにイミキモドで誘導しGPPモデルマウスを作製した。このマウスに皮疹に対して抗IL-17抗体と好中球の遊走を阻害するCXCR2阻害薬に治療効果があることを示した。

T細胞依存性抗原で刺激され活性化されたB細胞は胚中心を形成し、ここで高親和性記憶B細胞が産生される。産生された記憶B細胞は胚中心を離れ、長期の寿命を持って体内に維持され、二次免疫応答で迅速に抗体産生細胞に分化する。しかし、長期生存維持を司る分子機構は不明で、また、記憶B細胞の正確な組織局在やホーミングを司る分子は同定されていない。我々はこれまでに記憶B細胞で発現増強する遺伝子のクローニングを行ない、記憶B細胞で発現増強する多数の細胞内、細胞表面蛋白の遺伝子を同定した。解析の結果ヒト脊髄筋萎縮症の原因遺伝子であるSMN1遺伝子のマウスホモログが記憶B細胞及び胚中心B細胞に強発現し、試験管内で誘導されるアポトーシスを抑制する可能性が示唆された。更にSMN C末端領域はIgG1胚中心B細胞及び記憶B細胞の産生に必要であることが明らかにされた。また、獲得された遺伝子の解析から記憶B細胞がD6ケモカイン受容体を表面に発現することを明らかにし、記憶B細胞に高発現する新規遺伝子3940はERK6と相同性を有し、B細胞系列において記憶B細胞及び辺縁帯B細胞のみに高発現し、この遺伝子の発現が認められないB細胞株に強発現すると種々のアポトーシス培養条件下での細胞死に抵抗性を賦与されることを明らかにした。

敗血症におけるCRTH2の役割を検討した。CRTH2ノックアウト(-/-)マウスは、敗血症において生存率が上昇し、腹腔内の細菌数は有意に減少した。CRTH2-/-マウスは、腹腔内のCXCR2陽性の好中球が増加した。好中球マーカーであるGr-1の抗体や、CXCR2抗体の投与実験の結果、CRTH2-/-マウスの保護的効果の機序にCXCR2陽性の好中球の腹腔内への集積が寄与していた。感染2時間後の末梢好中球のCXCR2プロモーター領域のヒストンH3のアセチル化は、野生型では低下するが、CRTH2-/-マウスでは低下せず、CXCR2の発現はエピジェネティック制御を受けることが示唆された。

バイオフィルム感染症が慢性化，難治化する原因の１つとして抗菌薬抵抗性が重要であることは知られているものの，そのメカニズムについては不明な点が多い。休眠細胞と呼ばれる、増殖が完全に停止した細菌の増加が主要なメカニズムとして知られているが、我々はこれまでに，典型的なバイオフィルム形成細菌である緑膿菌を用いて、抗菌薬抵抗性に関与する因子として，RNAポリメラーゼσ因子，セカンドメッセンジャーであるc-di-GMP，菌体外多糖合成に関わるpsl遺伝子，２成分制御系など、細菌の増殖に直接関わりがないものの、ストレス応答などに関与する因子が重要な役割を担っていることを報告してきた。本研究では，cbrA-B, phoB-Rを中心とした２成分制御系に着目し，シグナル伝達経路を明らかにすることにより，抗菌薬抵抗性メカニズムの解明し，慢性難治性感染症であるバイオフィルム感染症に対する，新たな治療薬のターゲットを見出すことを目標としている。 本年度は、抗CbrB, 抗PhoBポリクロナール抗体の作製を継続して行った。その結果、His-Tag融合タンパク質用のベクターへcbrB, phoB遺伝子をクローニングし，大腸菌での大量発現，タンパク質の精製を実施し、ウサギに免疫することにより、抗CbrBと抗PhoBのポリクロナール抗体の作成に成功した。

SMN蛋白質はRNA結合蛋白(snRNP)複合体を構成し、代謝の転写後の機能を調節する可能性が推察されている。SMN遺伝子の欠損により、重篤な神経原性の筋萎縮症(Spinal Muscular Atrophy : SMA)が発症し、重症型では四肢および体幹筋萎縮および重篤な感染症を伴い生後2歳以内に死亡する。SMA患者あるいはSMAモデルマウスにおいて脊髄の運動神経細胞(脊髄前核細胞)の変性が観察されているが、生体でのSMNの機能とSMAの発症機序は不明である。我々はSMNが記憶B細胞に発現増強することを明らかにした。さらに、SMNの発現の低いB細胞株にSMNを強発現させると、試験管内での抗IgM刺激やFcS除去などで誘導される細胞死に対して抵抗性が賦与され、SMNが細胞の生存維持に関与する可能性が示唆された。またSMNによるsnRNP複合体の形成に必要なexon7をB細胞で特異的に欠失するマウスを用い、B細胞におけるSMNの機能を解析した。この結果、SMNexon7欠損では胚中心B細胞、記憶B細胞の産生が強く抑制されることが明らかにされた。この作用起点を明らかにする目的で、活性B細胞、抗体産生細胞でのSMN結合蛋白質を同定しその結合部位を特定した。この結果、SMNはB細胞においてsnRNP複合体の形成の他にDNA polymerase δ, hsnRNP U, AKAP95, AIFが結合することを明らかにした。AIFの強発現はH_2O_2依存性アポトーシスへの抵抗性に賦与するが、SMNの結合に必要となるFAD結合領域を欠いた変異体はこの機能を消失することを明らかにした。

目的:本研究では、SARS-CoVに対する有効なワクチン開発のための基礎的研究を行うことを目的とする。成果:ヒトに即時に応用することが可能なワクチンとして、マウスモデルにおいてUV照射不活化ウイルス粒子ワクチンを皮下に2回接種し、これにより誘導される免疫応答を解析した。その結果、中和活性のあるIgG抗体がUV照射不活化ウイルス粒子のみで誘導可能であり、しかも長期に存続すること、アラムアジュバントを使うことにより抗体価は更に10倍以上高まることを明らかにした。安全性を更に高めるためにUV照射にホルマリン処理を加え、UV照射のみの不活化ウイルス粒子により誘導される免疫応答との比較を行った。ホルマリン処理したUV照射不活化ウイルス粒子免疫群と未処理のUV照射不活化ウイルス粒子免疫群とで血中のSARS-CoVに対するIgG抗体価を比較すると、ホルマリン処理をすることにより血中抗体価が多少低下する傾向はあるものの、中和活性のある抗体の誘導は十分可能であった。これらのマウス骨髄中のSARS-CoVのNucleocapsidに対する抗体産生細胞数は両群ともに増加しており、その数に有意差は認められなかった。また、ワクチン接種部位の所属リンパ節(腋下)のT細胞はウイルス粒子抗原に反応していくつかのTh1/Th2タイプのサイトカインを産生するが、ホルマリン処理群では非処理群と比較してIFN-の産生量がやや高く、IL-5産生量はむしろ低い傾向にあった。一方、投与部位に関しては、石井孝司博士(感染研ウイルス2部)が開発したSARS抗原を発現する弱毒ワクシニアウイルス(DIs)ワクチンを用いて皮下接種と経鼻接種における感染防御効果を比較した。経鼻免疫で誘導される鼻腔粘膜IgA抗体は皮下免疫ではほとんど誘導されないにもかかわらず、高濃度の血中IgG抗体に依存してSARS-CoVの呼吸器感染に対する防御効果が認められた。従ってUVとホルマリンで不活化したウイルス粒子によるワクチンは、即座にヒトに応用可能な安全性の高いSARSワクチンとしてのみならず、今後の新興感染症への緊急対策として有効であることが示された。