共同研究・競争的資金等の研究課題

生殖細胞系列で転移と増殖を繰り返すレトロトランスポゾンは、生命の次世代継承にとって脅威である。非コード小分子RNA（piRNA）とPIWIタンパク質の複合体は、配列情報と相補的なレトロトランスポゾンを抑制し、ゲノムの恒常性を維持している。本研究ではPIWI-piRNA経路の解析を通じて、宿主が非自己であるレトロトランスポゾンを寛容・承認し、「ゲノムの恒常性を維持しつつ進化していく過程」の理解を目的としている。生殖細胞に発現するPIWI-piRNA経路の機能は、倫理的な問題からヒトでの解析は困難であり、マウスを使った場合でも試料の少なさから生化学的解析が遅れている。そこで、本研究では機能的PIWI-piRNA経路を保持するヒトまたはマウス培養細胞株の確立を目指している。Fred Gage博士の研究チームは、霊長類であるヒト、ボノボ、チンパンジーのiPS細胞を構築し、RNA-seqによる遺伝子発現パターンを比較した。その結果、ヒトiPS細胞では、他の二つの霊長類iPS細胞に比べて、PIWI遺伝子の一つPIWIL2の発現量が高いことが明らかとなった。我々もヒトiPS細胞内でPIWIL2のmRNAを検出できた。以上の結果から、ヒトiPS細胞は我々の求める「機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株」の第一候補となっている。しかしながら、この報告を含めてこれまでにヒトPIWIL2-piRNA複合体の実体は検出されていない。そこでヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体を作製した。残念ながらヒト精巣抽出液を用いたウェスタンブロッティング法ではヒトPIWIL2の発現を確認できるものの、ヒトiPS細胞でヒトPIWIL2の発現は検出できなかった。現在、ヒト精巣腫瘍由来細胞株に着目してヒトPIWIL2-piRNA複合体を発現する細胞株の探索を続けている 現在までに、ヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体の作製に成功している。ヒトiPS細胞ではmRNAレベルでヒトPIWIL2の発現は確認できたものの、タンパク質としては発現していないことが明らかとなった。したがって我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の候補から、ヒトiPS細胞は外れることになった。一方で、ヒト精巣抽出液由来のヒトPIWIL2タンパク質の検出ができていることから、我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の探索の準備は整った。 これまでにmRNAレベルにおいてPIWIL2を発現する培養細胞株が多数報告されている。それら細胞株を取り寄せて、構築したヒトPIWIL2に対するモノクローナル抗体を用いて評価を行う。また、免疫沈降法により結合している小分子RNAの有無を評価することにより、我々の求める機能的PIWI-piRNA経路を保持する培養細胞株の探索を続ける。また、培養細胞の改変により求める細胞株の構築を試みる。転写因子A-MYBはマウスにおいてpiRNA前駆体をはじめ、PIWI-piRNA経路に関わる遺伝子（Piwi1, Piwil2, MitoPld, Mov10l1, Vasa等）の転写反応を正に制御しているが明らかとなっている。したがって転写因子A-MYBの強制発現により機能的PIWI-piRNA経路を保持する細胞株が得られると考えている。候補となっている細胞株にA-MYBの強制発現を予定している。

ピストンとDNAの複合体であるクロマチン構造は、ゲノムDNAをコンパクトに収納しつつ遺伝子の発現制御に関わっている。ヒストンシイペロンはクロマチン構造の動的変動に関わる因子の一つである。多数のコアヒストンバリアント特異的なヒストンシャペロンが同定され機能解析が進んでいる。ところが、哺乳類細胞におけるリンカーヒストンH1シャペロンの実体はほとんど明らかでなかった。そこで我々はリンカーヒストンシャペロンの同定とマウス発生過程における機能解析を進めてきた。Flagタグを付加したピストンH1を恒常的に発現するHeLa細胞を樹立し、細胞核抽出液画分より精製したH1相互作用タンパク質について、質量分析による網羅的な同定を試みた。これにより、Template Activating Factor(TAF-I)が新規のヒストンH1結合タンパク質として同定された。TAF-1は試験管内でヒストンシャペロン活性を持ち、細胞内でヒストンH1の核内動態に関与することを見出した。次に生体内におけるTAF-1の機能を解析するため、TAF-1ノックアウト(KO)マウスを作製した。TAF-I KOマウスは、野生型に比べ胎生8.25日目から徐々に成長が遅れ、未熟な血管形成と重度な貧血を示し、胎生12.5日目までに致死であった。TAF-I KOマウスで観察された成長の遅延を詳細に解析するため、TAF-I KO ES細胞を構築した。TAF-I KO ES細胞は細胞分化を誘導すると、野生型に比べ顕著に細胞増殖速度が低下した。またヒストンシャペロン活性を欠失したTAF-1変異体の発現では、その細胞増殖速度の低下を回復することができなかった。以上の結果から、TAF-1はヒストンシャペロンとして発生分化過程の細胞増殖速度を維持し、正常な組織の形態および機能の形成に関与すると考えられる。

rRNA遺伝子の転写反応は厳格な種特異性を示す。ヒトrRNA遺伝子はマウス細胞内で転写されず、またマウスrRNA遺伝子はヒト細胞内で転写されない。この種特異的転写は、マルチサブユニット因子SL1（ヒト）およびTIF-IB（マウス）に起因する。SL1/TIF-IBはrRNA遺伝子のコアプロモーターを認識し、転写開始点を規定する。rRNA遺伝子の転写開始反応を支配する複合体であるにもかかわらず、これまで構成因子によるSL1/TIF-IB活性の再構成はなされてこなかった。我々は、マウス細胞内においてヒトrRNA遺伝子転写を再構成し、マウス細胞内におけるSL1活性にはヒト由来の4種類のTAFI（TBP-associate factor I）が必要かつ十分であることを示してきた。一方で、マウス由来の4種類のTAFIを発現させても、ヒト細胞内においてマウスrRNA遺伝子転写を再構成することができなかった。試験管内転写反応系においても、HeLa細胞核抽出液はマウスF9細胞核抽出液を用いたマウスrRNA遺伝子転写を阻害した。また、マウスF9細胞核抽出液はHeLa細胞核抽出液を用いたヒトrRNA遺伝子の転写反応を阻害することが明らかとなった。そこで、SL1とTIF-IBはそれぞれマウスとヒトのrRNA遺伝子転写に干渉する可能性を検討した。マウス細胞内においてSL1構成因子の過剰発現は、マウスrRNA遺伝子の転写反応を強く抑制した。また、siRNAを用いてSL1構成因子の発現抑制を試みたところ、HeLa細胞内においてTIF-IB構成因子の過剰発現によりマウスrRNA遺伝子の転写に成功した。以上の結果から、HeLa細胞内におけるマウスrRNA遺伝子転写では、SL1がTIF-IB活性に干渉することが明らかとなった。 26年度が最終年度であるため、記入しない。 26年度が最終年度であるため、記入しない。

生物の発生分化は時間的、空間的制御を受けた遺伝子の発現パターンにより決定される。遺伝子発現のパターンは転写因子のネットワークにより構築され、ヒストンを始めとするクロマチン構造によって固定化されると考えられている。しかし、発生分化過程のクロマチン構造の動的変動の機構と役割については多くが不明である。我々はヒストンシャペロンであるTemplate Activating Factor(TAF)-Iに着目し、発生過程におけるクロマチン構造の果たす役割を検討することとした。そこでTAF-Iノックアウト(KO)マウスを作製したところ、重度な貧血と未熟な血管形成が見られ、胎生12.5日目までに致死であった。10.5日胚におけるTAF-Iの発現パターンを間接蛍光抗体法により検討したところ、TAF-Iはすべての組織で発現していた。TAF-I KO胚では野生型胚に比べ胎生8.25日目から徐々に発生が遅れていることが観察された。TAF-I KO胚の発生の遅れは一様ではなく、10日目から遅れ始める個体も観察され、様々であることが明らかとなった。10.5日胚を用いた網羅的遺伝子発現解析により、TAF-I KO胚では低酸素に応答する遺伝子群および解糖系に関連する遺伝子群の発現量が増加していることが明らかとなった。以上の結果からTAF-I KOマウスは血液・血管の発生異常に伴い、低酸素状態からエネルギー不足となり死に至ると考えられる。現在、TAF-I KO ES細胞の構築に成功し、血液・血管の形成を始めとする細胞分化におけるTAF-Iの機能を解析中である。

精子形成の過程で、精子核は遺伝情報を次世代へと伝えるために特化した高度に凝集したクロマチン構造をとる。我々はアデノウイルスの感染サイクルと精子形成・受精過程の生物学的類似性に着目した。アデノウイルスクロマチンをリモデリングする活性を持つヒストンシャペロンTAF-Iは精子核クロマチンを膨潤する活性を持つ。本研究の結果、TAF-Iは細胞の分化にともなう細胞増殖に重要であり、またマウス個体の発生に必須であることが明らかとなった。

生殖細胞系列で転移と増殖を繰り返すトランスポゾンは、生命の次世代継承にとって脅威である。非コード小分子RNA（piRNA）とPiwiタンパク質の複合体は、配列情報と相補的なトランスポゾンを標的とし、周辺にヘテロクロマチンを形成することで抑制している。我々はPiwi-piRNA複合体と相互作用し、トランスポゾンを抑制する因子としてNxf2 (Nuclear RNA export factor 2)を同定した。Nxf2はmRNAの核外輸送に関与はせず、ヘテロクロマチンを形成する前にトランスポゾンの転写反応を抑制することを明らかにした (Murano K et al., EMBO J 2019)。しかし、その転写抑制メカニズムは不明である。本研究では、転写と共役させた系を用いてNxf2の相互作用因子を探索し、Piwi-piRNA経路によるトランスポゾンの転写抑制機構を解明する。 本研究では、Nxf2-p15-Panx複合体によるトランスポゾンの転写反応抑制機構の解明を通して、Piwi-piRNA経路による生殖ゲノム恒常性維持の全体像を理解する。これまでに、Piwi-piRNA経路によるトランスポゾンの転写抑制は、少なくとも二段階に分けられることが分かった。特に初期段階での転写抑制機構に焦点をあて、転写と共役させた誘導係留レポーターシステムを用いて新生mRNA上におけるNxf2-p15-Panx複合体の相互作用因子の探索を行なった。新生mRNA上へ係留されたラムダNタンパク質を融合したNxf2を免疫沈降法により精製し、相互作用する因子を質量分析法により多数同定した。今後、同定した因子のトランスポゾン 抑制活性を評価し、Piwi-piRNA経路による転写反応と共役した転写抑制機構の解明を目指す。

ゲノムの膨大な領域（ヒトでは40%以上）を占めるトランスポゾンは、ゲノムに内在する変異原であり、転移を繰り返すことで宿主ゲノムを損傷するものと考えられてきた。つまりトランスポゾンは宿主によって抑制されなければならない対象である。一方、近年のゲノム解析の進展から、トランスポゾンはゲノム進化の原動力であると考えられるようになった。トランスポゾンは、宿主の遺伝子発現系に取り込まれ（Co-option）、複雑な発生を可能にする遺伝子プログラムの構築に寄与するというモデルが提唱されている。本研究では、トランスポゾンのもう一つの側面、すなわち宿主の遺伝子プログラムへの貢献という観点に立ち、マウス初期胚発生期に一過的に発現するトランスポゾンと宿主の相互作用に着目する。初期胚とES細胞を用いて、それらがどのように全能性制御に関わるか解明し、トランスポゾンと宿主の共生関係の理解を目指す。 マウスのレトロトランスポゾンMuERVL（マーブル, Murine Endogenous RetroVirus with Leucine tRNA primer）はゲノム内に1000コピー以上存在する。マウス初期胚、特に全能性を保持する2細胞期胚において一過的に大量発現し、全能性の喪失と同調して消失する。MuERVLのコードするGagタンパク質は多量体を形成し、自身のRNAと結合することが明らかとなった。FISHと免疫染色法を用いた解析からマウス2細胞期胚の細胞核に局在するMuERVL RNAは徐々に細胞質へと排出され、4細胞への分裂直前には全て細胞質へと移動し、Gagタンパク質と共局在する様子が観察された。現在、Gagタンパク質と相互作用する宿主mRNAの動態について観察を続けている。