共同研究・競争的資金等の研究課題

本研究では、高濃度酸素療法の肺癌治療への臨床応用を目指した研究を進める。現時点までに、高濃度酸素が、癌細胞における相対的ATP不足状態をもたらす事、癌抑制遺伝子であるAMPKが活性化する事、それによって癌の増殖能が低下する事を明らかにしている。本研究では、我々の独自の研究基盤を用いて、高濃度酸素療法が癌細胞の増殖を抑える分子機序を詳細に明らかにするとともに、どのような肺癌患者に有効なのか、どのような投与量、治療スケジュールあるいは併用療法が有効なのかを前臨床レベルで明らかにする。本研究を通して、「酸素を用いた癌治療」という新たな癌治療の扉をひらきたい。 本研究の目的は、高濃度酸素療法の癌治療における効果を前臨床レベルで検証し、臨床への導出に向けた知見の取得を行うことである。今までの研究で、一部の肺癌細胞がATP産生経路に強く依存していること、高濃度酸素が代謝に関わる酵素の機能を低下させATP産生を阻害し「相対的ATP欠乏」状態を引き起こすこと、それによって癌抑制遺伝子を活性化し癌の進行を抑制することを見出している（未発表データ、論文投稿準備中）。依然として、どのようなサブグループの肺癌に有効か、なぜ相対的ATP欠乏状態が癌細胞特異的に起こるのか、適切な酸素投与量とスケジュールはどのようなものか、有効な併用薬剤があるかなど明らかにされるべき課題は複数存在する。本研究ではこれらの検討を行い、新たな癌治療モダリティとして高濃度酸素療法の扉をひらきたい。酸素療法は、呼吸不全患者に広く使用されており、その安全性は十分検証されている。本研究を進めることで、特定のサブグループの肺癌患者に酸素療法が有効であることを証明できれば「酸素を使った癌治療」という新たなコンセプトを癌領域に導入できる。それによって、癌治療学を大きく変えられる可能性がある。 2024年度は、高濃度酸素療法が与える影響をさらに詳細に把握するために、複数の肺癌細胞株、気道上皮細胞株に対して、高濃度酸素療法の暴露を行ったうえで、RNAシークエンスを実施した。その結果、高濃度酸素暴露によって癌細胞特異的に相対的飢餓状態が誘導されることを確認している。また、この飢餓状態の誘導に関わる酵素として我々が注目する遺伝子に関してドキシサイクリン依存性ノックダウンモデルの作成を開始した。これにより、本遺伝子の肺癌細胞における影響を、増殖能や腫瘍形成能、代謝の観点から評価することを考えている。 高濃度酸素療法が癌細胞に与える影響を評価する上で行ったRNAシークエンスでは、今までの研究から想定していた変化が認められている。また、コンディショナルノックダウンの系も順調に作成できておりおおむね順調に進んでいると考えている。 作成したコンディショナルノックダウンシステムの肺癌細胞で、細胞増殖能、腫瘍形成能などのフェノタイプの変化を評価する予定である。また、我々は約300ラインからなる患者由来肺癌オルガノイドライブラリーを樹立している。今後、高濃度酸素療法をこれらの一部のラインに行い、感受性群と非感受性群を分けたうえで、感受性群を予測するバイオマーカーの同定を目指す。

小細胞肺癌は患者由来の組織検体採取が困難であることからヒト由来の疾患モデルが限られ、分子異常（遺伝子変異やエピジェネティクス異常）の同定やその生物学的意義の検証が充分に進んでいない。小細胞肺癌の生物学理解を深め新規治療法を開発して患者予後を改善するには、同定された分子異常が小細胞肺癌発癌に与える影響を一つずつ解明する必要がある。 本研究では、これら独自の研究基盤を用いて同定した小細胞肺癌の分子異常について、遺伝子改変技術等を用いて小細胞肺癌発癌過程における意義を前向きに検証することで、小細胞肺癌発癌過程を解明することを目的とする。

肺扁平上皮癌の分子異常は同定されてきたが、未だ個別化医療に発展していない。申請者らは現在までに、21ラインから成る世界最大の患者由来肺扁平上皮癌オルガノイドライブラリー構築に成功した。本研究の目的は、この独自の研究基盤を活用して遺伝子変異・mRNA発現量・転写活性などの遺伝情報を包括的に収集し、微小環境ニッチ解析やmetabolome解析を施行することにより肺扁平上皮癌細胞のシグナル経路異常を規定するメカニズムを解明することである。

本研究では、多様な抗癌剤に対する獲得耐性機序を明らかにするとともに、その中から新規治療標的を同定し獲得耐性克服に向けた治療戦略の開発ことを目的としている。そのために、我々が樹立した肺癌オルガノイド実験基盤を用いた研究を行う。具体的には、耐性化後に取得した臨床検体から肺癌オルガノイドを樹立し、それに対するゲノム解析やRNAシークエンスなどを行い、各耐性化ラインでの耐性化機序を分子レベルで明らかにする。また、同定した獲得耐性機序を克服するための薬剤のスクリーニングを行い、耐性化後に有効な薬剤の同定も試みる。

FBXO17の発現を抑制することにより、試した８種類の細胞のうち６種類の肺癌細胞株の細胞増殖の阻害を認めた。さらにFBXO17過剰発現細胞を用いてEGFR経路活性化に与える影響を検討したところ、一部の細胞でERKのリン酸化の上昇を認めた。また、細胞周期のG1/Sチェックポイントに影響を与えている可能性が示唆された。 本研究ではFBXO17の結合タンパク同定には至らなかったことから機能を直接的に説明することはできなかったものの、FBXO17が肺癌細胞の増殖、細胞周期、EGFR経路に影響を及ぼす因子であることを見出した。

本研究代表者は肺癌の腺癌と扁平上皮癌の組織分類診断マーカーとなりうる分子として3つのmicroRNAを同定した(Molecular Medicine Reports, 2013)。また、3分子のうちの1つであるmiR-375 の過剰発現が肺癌細胞株の浸潤能を促進することを発見した。その機序に関わるmiR-375の新たな標的遺伝子の候補として、Claudin-1 を見出すことができた。

本研究では肺癌患者検体からオルガノイドライブラリーを作成する。ライブラリーに対して全遺伝子を個別にノックアウトできるシステムであるCRISPR/Cas9スクリーニングを施行する。同じ遺伝子学的バックグラウンドを持つ非癌部肺からもオルガノイドを作成し対照として使用できることから、癌部に特異的な新規治療標的を同定し、副作用が少ない治療開発につなげることができる。また、オルガノイドはその樹立にかかる期間が短いことが知られていることから、得られた有用薬剤などの情報を患者生存中に還元することも可能になると考えられる。 本研究では根治性の高い肺癌の新規治療法の開発を行い、肺癌患者の予後を改善することを目的とし、肺癌患者検体からのオルガノイドライブラリー作成とライブラリーに対して全遺伝子を個別にノックアウトできるシステムであるCRISPR/Cas9スクリーニング施行することにしている。 ライブラリー作成に関しては申請前までに樹立していた細胞株に加え、新たに外科手術、気管支鏡検査、胸水穿刺、喀痰、CTガイド下生検から得られた検体からの樹立を継続して行い、腺癌、扁平上皮癌、小細胞肺癌、大細胞神経内分泌癌など臨床に即した組織型を含むライブラリーの拡張に成功した。各検体のWhole exome sequenceを行うことにより変異情報を集めて既存のTCGAデータとの比較検討を行った。また、培地のニッチ因子の検討を行うことにより肺癌細胞の増殖に必要なシグナルの探索を行っている。このシグナルの探索により、肺癌の新規治療法の標的となるpathwayや遺伝子候補が見つかると考えている。さらに、見つかったシグナルの阻害を行うことにより、肺癌の治療法になる可能性があるので、この可能性をマウスxenograftで検討している。 CRISPR/Cas9スクリーニングに関しては、研究分担者及び協力者が既に行っていた方法で肺癌オルガノイドで目的の遺伝子がノックアウトできること、また、sgRNAライブラリーを用いた網羅的なノックアウトスクリーニングもできることを確認できた。 予定通り進んでいる。 引き続き肺癌ライブラリーの拡張を行う。 CRISPR/Cas9スクリーニングに関しては、樹立したライブラリーのうち、発癌機序が不明の検体に関してスクリーニングを施行し、肺癌の新しい治療標的探索を目指す。

申請者らは、以前より新奇な遺伝子変異を有する肺癌に注目し、我国最大の癌ゲノム解析ネットワークであるSCRUM-Japanとの共同研究により、肺癌における新奇な遺伝子異常の頻度と分布の把握を行うともに、得られた遺伝子変異情報を用いて各 遺伝子変異の薬剤感受性試験を行うシステムの構築を行ってきた。 本研究では、これら独自の研究基盤とSuper computerを用いたin silicoでの感受性予測システムを用いて、新奇な遺伝子異常を有する肺癌患者に最適な治療方法を提案できるシステムを構築する。その上で稀な遺伝子異常を有する肺癌に対する新たな治療戦略の提案を行う。 2019年度は、肺癌患者由来の遺伝子変異を導入したBa/F3細胞minor mutation libraryの作成と薬剤感受性データの取得するため、LC-SCRUM Japanにおける3800例弱の非小細胞肺癌患者から匿名化された遺伝子情報と臨床情報からをもとに稀な遺伝子変異情報を取得し、稀な変異を有する遺伝子をBa/F3細胞に導入することにより得られた、種々の薬剤に対する感受性結果をまとめた。すなわち同じNGS解析装置を用いて解析された約2000例の症例の内、EGFRに関する稀な遺伝子変異の割合は5.5%であること、特に頻度の多い稀なEGFR遺伝変異はexon 20挿入遺伝子変異で稀なEGFR遺伝子変異の約半分を占めること、これらの遺伝子変異はいずれもドライバー変異であり、他のドライバー変異とは相互排他的であることを明らかにした。さらに種々のEGFR exon 20挿入遺伝子変異に関する薬剤感受性の検討において、in vtrioでの薬剤感受性で求めたIC50とスーパーコンピューターを用いたin silicoでの感受性予測システムにより求めた結合自由エネルギーの間には極めて高い相関性があることが明らかとなり、in silicoでの薬剤感受性予測の実現可能性を示すことができたことから、本研究結果を学術論文誌（PNAS）に発表した。 一方、生きた肺癌細胞をreal timeに解析する方法として肺癌症例からオルガノイドを中心に樹立を行っているが、これまで肺腺癌を中心に50株以上の肺癌および正常肺のオルガノイドの樹立に成功しており、一部稀な遺伝子変異を有する株の樹立にも成功した。 2019年度は、大きな目標の一つであった、稀な遺伝子変異のため薬剤感受性に関する情報がなく、治療法の提案ができない遺伝子異常に対して、super computorを用いてin silicoで薬剤感受性を予測することが可能かどうかの検討を行い、少なくともEGFR exon 20挿入遺伝子変異においては、in vtrioでの薬剤感受性結果とsuper computorによるin silicoでの予測結果に極めて高い相関が得られることを示すことができ、かつ論文による発表も行えたことから研究の進捗は概ね順調と考えられる。 一方、オルガノイドについては、これまで肺腺癌を中心に50株以上の肺癌および正常肺のオルガノイドの樹立に成功しており、一部稀な遺伝子変異を有する株の樹立にも成功していることから、こちらについても進捗は順調と考えられる。 2020度も継続して、LC-SCRUM Japanから取得する遺伝子変異情報をもとに、より頻度の多いもの、臨床的に重要であると考えられるものを優先して、他の稀な遺伝子変異に関する解析を行う。 一方、稀な遺伝子変異を有する肺癌患者の生きた癌細胞として、細胞株およびオルガノイドの樹立も継続して行っていく。オルガノイドについては、これまで肺腺癌を中心に50株以上の肺癌および正常肺のオルガノイドの樹立に成功しており、一部稀な遺伝子変異を有する株も含まれている。本年度はこれら稀な遺伝子変異を有する株について、genetic およびepigeneticに包括的な解析を行い、他のmajorな遺伝子変異との生物学的差異等に関する検討を行う。オルガノイドの検体としては、手術検体だけでなく、気管支鏡検体、胸水、喀痰、さらに血液から得られた検体も用いて樹立を行っていく予定である。