共同研究・競争的資金等の研究課題

肥満が心血管病のリスクであるのと同様、筋肉量減少がその本体であるサルコペニアも、心血管病発症のリスクとなる。インスリン不足は糖尿病の発症原因となり、また筋肉の蛋白同化障害を惹起しサルコペニアの原因ともなる。しかしながら、インスリン不足からサルコペニアが生じる機序の代謝学的観点からの機序解明と、原因に則した治療法の開発は、未だ不十分である。我々はこれまで、栄養素の代謝がサルコペニアの進展に与える意義を検討するため、加齢マウスなどのサルコペニアモデルマウスにおいて、メタボローム解析を用いて、骨格筋内の代謝産物(糖, アミノ酸, 脂質とそれらの代謝産物)の変容と、サルコペニア進展の関連を検討してきた。その結果、サルコペニアの進展が筋肉構成蛋白の基質である、アミノ酸の代謝と密接に関連することを見出してきた。 本年度までに、著明なサルコペニアをきたす、ストレプトゾトシン(STZ)投与によるインスリン欠損1型糖尿病モデルマウス(STZマウス)においてメタボローム解析を行い、白筋, 赤筋のサルコペニア進展と関連した代謝産物の変容を検討した。その結果、血糖値400~600mg/dlの高血糖をきたしたSTZマウスの筋肉で, 野生型マウスと比較して変化が大きい代謝産物は、解糖系やTCA回路よりもむしろアミノ酸に多いことを見出した。インスリン欠損に伴う筋肉の分解亢進ならびに、合成低下に伴いアミノ酸は全体的に増加するが、その中でも分枝鎖アミノ酸(BCAA)であるバリン, ロイシン, イソロイシンの増加が、特に顕著であることを見出した。その一方で、1型糖尿病モデルマウスの筋肉で減少し、高蛋白食投与を行っても増加せず、低蛋白食投与の場合と同等の濃度となるアミノ酸があることも見出した。

我々は、多能性幹細胞因子と考えられていたZfp281というタンパク質に、心筋細胞への強力な転換促進作用があることを発見した。さらに予備実験から、このタンパク質がマウスにおける心臓の発生に必須であり、さらにヒトの心臓疾患に関連する重要な因子と相互作用することがわかった。 本研究では、皮膚細胞から心筋細胞を作るリプログラミング技術と遺伝子改変マウスを用いて、Zfp281を中心とした心臓形成の新しい仕組みを解明する。また、心疾患に関連する遺伝子変異を持つマウスモデルを作製・解析することで、ヒト疾患発症の仕組みを明らかにし、新たな治療法開発の基盤を構築する。

本研究では血管内皮細胞NAMPT-NAD(+)合成系の肥満2型糖尿病発症における役割を検討することを目的としている。具体的には、①血管内皮細胞特異的Namptノックアウト(Vascular endothelial cell-specific Nampt knockout: VeNKO)マウスを用いた、血管内皮細胞NAMPT-NAD(+)合成系のエネルギー代謝障害・インスリン抵抗性発症における役割、②NAD中間代謝産物NMN (nicotinamide mononucleotide）を用いた血管内皮細胞NAD(+)量の回復が肥満2型糖尿病発症を予防するか、を検証事項とする。これらにより、肥満2型糖尿病発症における血管内皮細胞NAMPT-NAD(+)合成系の役割が明らかとなり、血管内皮細胞NAMPT-NAD(+)合成系を標的とした肥満2型糖尿病の新規予防法開発につながると考えている。 2021年度は、Nampt-floxed マウスと、血管内皮細胞で Creを発現する VeCadherin-Creマウスを用いて、VeNKOマウスの作成に成功した。通常食投与下においては、2-3ヵ月齢までには、体重を含めたエネルギー代謝、糖代謝は、コントロール群と比較して、有意な差がないことを確認した。そこで、高脂肪食負荷を行っている。コントロール群と比較し、体重には有意な変化を認めないものの、fat・glucose oxiadation、脂肪分布に変容を呈することを見出した。また、腹腔内インスリン負荷試験より、VeNKOマウスでは、コントロール群のマウスと比較して有意なインスリン抵抗性を呈することを見出した。

概日リズムと代謝恒常性の関連は深く、リズムの障害は癌、メタボリックシンドローム、睡眠障害など幅広い疾患の病態生理への関与が示唆されている。本研究はT細胞が活性化する際の増殖代謝と 概日時計の関与を検討した。野生型、Bmal1欠損マウス脾臓のCD4陽性Tリンパ球のサブセットの割合に差は見られなかった。一方で、ナイーブT（Tn）細胞を単離、培養し、CD3/28抗体で刺激したところ、Bmal1欠損Tnで細胞分裂が亢進し、細胞数の増加が観察された。また、Tn細胞の遺伝子発現を検討したところ、解糖系、グルタミン酸化酵素の遺伝子発現の亢進を認めたほか、MYC蛋白発現がBmal1欠損Tnで亢進していた。

概日時計は、変動する環境に対し予測的に生体活動を適応させる生体恒常性維持機構であり、昼夜の明暗リズムを基盤に、摂食と空腹、睡眠と覚醒などによって修飾され、概日リズムを作り出している。時差症候群やシフトワークにより生じる概日リズム障害は、肥満症や糖尿病、心血管病の危険因子であることが疫学的に広く知られているが、その機序は必ずしも明らかではない。妊娠中の母体においても概日リズムの維持は、安定した周産期と児の成育に重要であると考えられ、実際にシフトワーカーの妊婦では低出生体重児が多いことが報告されている。この低出生体重は成人後の疾病のリスクであり、子宮内の児の発達により、児の将来の様々な疾患感受性が決定されることが示唆されている。しかし、母体の概日リズムが、胎児の発達および児の成育と将来の疾患感受性に与える詳細な影響は明らかではない。そこで本研究では、妊娠母体の概日リズム障害が、胎盤を通過する液性因子のリズム変調を介して、臓器形成、および、その後の疾患感受性を決定すると仮説を立て、液性因子を介した母児間のリズム獲得不全が仔の疾病発症に与える影響を、「代謝リズムパネル」を駆使して、多層多元的に解明することを目的としている。 C５７BL/６マウスを妊娠期間中のみ、12時間明暗周期の環境下または、５日に１回、８時間位相を早めるサイクル（Continuous Phase Shift: CPS）で飼育した。両群の妊娠期間や出産個体数に有意差は認められなかったが、出生直後の児の体重は、CPS群で有意に低下していた。その後、オスの児を生後４週から１２週にわたり、12時間明暗周期の環境下で低脂肪食負荷を行ったところ、対称群とCPS群の間に体重、脂肪重量、肝臓重量、糖負荷試験による耐糖能に有意差は認められなかった。今後、高脂肪食負荷を行い、CPSによる代謝の長期的影響を検討する予定である。

本研究では、「母体のリズム障害が、胎盤を通じた栄養シグナルの障害を介して、児にリズムの同期不全と変調を惹起し、児の適切な臓器発育を妨げ、低出生体重と関連する生活環境病の危険因子となる」、という仮説を検証する。本提案では、光環境や時計遺伝子変異による概日リズム障害モデル妊娠マウスを用いた母児リズム脱同調による子宮内胎児発育不全、産生仔の食行動異常、肥満の増悪の分子メカニズムを、特に、胎盤のシングルセル解析や母体血中のエクソソームに着目して検討する。すでに保有する数百例の母体妊娠時情報、出生児13歳までのフォローアップデータとその胎盤サンプル、母体血清エクソソームについて上記結果を検証する。

【目的】2002年にヒト腎臓からクローニングされた(プロ)レニン受容体[(P)RR]の遺伝子配列はV-ATPaseのVo sectorと局在を共にする蛋白であるATP6AP2と同一であり、アミノ酸配列は(P)RRの膜貫通ドメインを含むC末端側がATP6AP2であった。しかし、V-ATPaseはオルガネラの酸性環境の維持に必須であることが知られている一方で、ATP6AP2の生理的な役割は不明であった。 【方法】我々はFloxed(P)RR transgenic mouse由来の胎児線維芽細胞と心筋細胞特異的発現Cre発現マウスとの交配によって得た心筋特異的欠損モデルマウスを用いて(P)RR/ATP6AP2の生理的な役割を検討した。 【研究実績の概要】Floxed(P)RRマウスより採取した胎児線維芽細胞にCreアデノウイルスベクターを感染させ(P)RRを欠損させたところ、Vo sector選択的にサブユニットのタンパク発現の減少を認め、オルガネラの酸性環境が障害されていた。心筋特異的(P)RR欠損マウスは、生後約3週間で拡張型心筋症様の心不全を発症し死亡した。心筋組織において核周囲の著明な空胞変性と線維化を認め、これらの空胞はMulti-vesicular bodyやautophagosomeから構成され、後期エンドソーム/ライソソームのマーカーであるRab7、Lamp-2が陽性であった。更に心臓組織のLC3-IIやp62のタンパク発現亢進を認め、autophagosomeの増加が示唆された。オルガネラの酸性化障害が同様な細胞変化を起こすかを検討するため、BafilomycinおよびChloroquineをラット初代培養心筋細胞に投与したところ、両薬剤ともにRab7陽性の空胞形成が認められた。以上よりオルガネラの酸性化障害が後期エンドソーム/ライソソームの蓄積をもたらしていると考えられた。

我々は線維芽細胞から心筋細胞を作製する直接分化転換法の研究において、幹細胞の多能性維持に働く転写因子Zfp281に非常に強い心筋分化 転換作用がある事を見出した。そして予備実験においてZfp281が心筋分化と心臓発生に必須な因子であることも示唆されている。 よって、本研究ではこのZfp281と心臓形成の予想外な関連性に着目し、様々な遺伝子改変マウス及び遺伝子発現・エピゲノム解析を用いて、 Zfp281を中心とした心臓形成の新たな転写制御機構を明らかにする。そして、最終的には研究成果を心疾患の新たな分子機序解明や心臓再生技 術の開発へと発展させることを目指す。 我々は線維芽細胞から心筋細胞を作製する直接分化転換法の先行研究において、幹細胞の多能性維持に働く転写因子Zfp281に非常に強い心筋分化転換作用がある事を見出した。よって、本研究ではこのZfp281と心臓形成の予想外な関連性に着目し、様々な遺伝子改変マウス及び遺伝子発現・エピゲノム解析を用いて、Zfp281を中心とした心臓形成の新たな転写制御機構を明らかにし、心疾患の新たな分子機序解明や心臓再生技術の開発へと発展させることを目指している。 我々は今までに遺伝子改変マウスを作成し、心臓中胚葉特異的Zfp281欠損マウスにおいて心奇形を認め、胎生致死であることを示してきた。また、心筋前駆細胞、心筋細胞特異的Zfp281欠損マウスは出生し、心臓にも特記すべき形態異常を認めないことから、Zfp281は心臓中胚葉から心筋前駆細胞に分化するタイミングで必須の因子であることを証明した。また、心臓中胚葉特異的Zfp281欠損胎仔マウスの心臓では右室流出路系の形成異常を認め、トランスクリプトーム解析では右室流出路形成に必須なマスター因子の発現低下を認めた。 2024年度はZfp281のChIP解析に基づき、これら右室流出路形成のマスター因子の転写調節領域（プロモーター、エンハンサー領域）を探索し、転写因子Zfp281の結合配列を複数発見した。そしてルシフェラーゼを用いたレポーターアッセイにより、Zfp281が直接これら右室流出路形成のマスター因子の転写を制御する事を確認した。よって、Zfp281は右室流出路形成のマスター因子の転写を調節することにより、心臓の発生に寄与していることが明らかとなった。 研究室内で人事異動があり、それに伴い研究環境の再整備を余儀なくされたため研究にやや遅れが生じている。 今までの各種遺伝子改変ES細胞やマウスを用いた実験により、心筋リプログラミング誘導因子Zfp281は心臓中胚葉から心筋前駆細胞に分化する段階で心臓発生に必須である事を明らかにし。また、心筋細胞分化後の恒常性維持にはZfp281は必須ではないことも明らかにした。つまり、Zfp281はやはり心臓や心筋細胞が形成されるときに重要な機能を担っている運命決定因子の一つであることが証明された。そして、Zfp281は心臓発生に重要な転写因子の発現を直接制御することにより、心臓の形成に寄与していることが明らかとなった。 しかし、Zfp281は遍在的に発現する遺伝子のため、心臓において特異的に作用する相互作用因子の存在が示唆された。我々は共免疫沈降を用いて、Zfp281が相互作用する複数の心臓発生に重要な転写因子群を同定しており、本年はこれら相互作用因子とZfp281が共同して心臓発生のマスター因子の転写を制御するか、各種遺伝子改変細胞やレポーターアッセイを用いて解析する。 以上より心筋リプログラミング因子Zfp281がどのような転写制御で心臓発生、心筋分化に寄与するかを明らかにする。