共同研究・競争的資金等の研究課題

骨格の形状は高度な左右対称形を示す。しかし、骨が左右対称性に形作られる形態形成の細胞機構は何かという学術的問いには答がない。本研究では、左右対称性の骨格形成のメカニズムを解明する。すなわち、①左右で鏡像の、軟骨細胞や骨芽細胞が存在するという細胞キラリティ仮説と、②皮質骨を挟んだ破骨細胞と骨芽細胞の対合メカニズム（トランスカップリング）が存在して骨周囲の臓器組織に応じて骨も左右対称性に変容し成長するというトランスカップリング仮説を検証する。 「骨が左右対称性に形作られる形態形成の細胞機構は何か」に答えるために、「細胞キラリティ仮説」と「トランスペアリング仮説」を追究した。「細胞キラリティ仮説」は、“骨芽細胞には、鏡像の左手型細胞と右手型細胞が存在して、左右対称の骨格を形成している”というものである。2021年度は、新生仔マウスの頭蓋冠由来の骨芽細胞を用いた培養実験で、概念実証が進んだ。すなわち、左右の前頭骨と頭頂骨から調製した初代骨芽細胞は、すべて右手型細胞の割合が、左手型細胞の割合よりも有意に高かった。サンプル数を増やすために、半自動的な定量解析方法を確立することを目指し、複数の方向性と平行性を数値化するソフトウエアを検討した。計算原理や説明が充実していて、すでに多数の生命科学の論文に応用されているものを比較検討し、本研究に適合しているものを見出した。 また、「トランスペアリング仮説」は、 “皮質骨を挟んだ破骨細胞と骨芽細胞の対合メカニズム（トランスペアリング）が存在して、成長過程で左右対称性の周囲組織の形態に応答し、骨が左右対称性に変容しながら成長する”というものである。2021年度は、組織学的解析を中心に、脛骨と腓骨などの長管骨におけるトランスペアリングの現象を組織学的手法、Ｘ線イメージング、蛍光イメージングで解析し、最初の論文の投稿を行った。現象論が中心だったので、さらにメカニズムを深めるための改訂作業を進める必要があるという認識に至った。 「細胞キラリティ」について：概念実証が進み、スループットを上げて解析力を高めるための独自のアイデアに到達できた。PDMSスタンプを用いたマイクロプリンティングの手法には、ファイブロネクチンの「インク」の乾き具合の調節が重要であるものの、実験者の経験と勘に依存している。新たなアイデアで、研究室の中で誰もができる技術として確立する必要がある。一方、解析に用いる画像解析ソフトウエアの検証が進み、OrientationJというImageJという汎用的な画像解析ソフトウエアのプラグインが、比較した中で最も目的に合致していることがわかった。 「トランスペアリング」について：マウスの腓骨を中心に、骨芽細胞と破骨細胞の皮質骨を挟んだ分布を解析し、以前に報告した頭蓋底だけでなく（Edamoto et al, 2019, Sci Rep）、長管骨でも「トランスペアリング」が起こっているという現象を示すことができた。しかし、その具体的なメカニズムについては不明であり、2022年度以降に解明を目指す。 推進方策１（細胞キラリティ検出系の高度化） フィブロネクチンのマイクロプリンティングの手法による、細胞培養レベルで右手型や左手型といった細胞のキラリティを検出する手法（Wan et al, 2011, PNAS）を、独自のアイデアで高度化し、スループットを上げて解析力を高める。具体的には、マイクロプリンティングのパターンをドーナツ型から直線の多い型にすること、PDMSスタンプにハンコのような持ち手を付けること、ステージ付きの電動ドリルの機構を利用して垂直にスタンプできるようにすることなどを検討する。 推進方策２（坐骨神経切除術を行ってトランスペアリングを解析する） 坐骨神経切除術を行うと、方向性をもったトランスペアリングが腓骨から消失することが分かった。その状態を対照群と比較しながらＸ線や蛍光を用いた3Dイメージングを行って、内向きトランスペアリングの方向や位置の制御メカニズムに、神経や筋肉、皮質骨を貫通する血管がどのように関わるのかを解明する。

我々が行った予備実験の結果、脊索腫細胞そのものが、骨浸潤部位において破骨細胞様のふるまいをし、酸性環境を作り出すことで骨破壊を引き起こしている可能性を見出した。本研究では、骨代謝学において蓄積のある破骨細胞研究の知見を元に、「脊索腫細胞自身が直接骨破壊を引き起こす」という仮説を検証することで、脊索腫における骨破壊の機序を解明し、それを標的とした新たな治療戦略の提言を目指す。

申請者は、軟骨内骨化組織を詳細に解析した結果、石灰化軟骨が骨形成の優れた基質となる可能性を見出した。申請者が独自に開発した骨芽細胞特異的にGFPを発現するマウスを用いることで、骨形成過程における骨芽細胞の増殖、移動、骨細胞分化といった動的指標を計測することが可能となる。そこで、より生体に近い骨片組織培養を用いて、骨形成過程における骨芽細胞の増殖能、移動能、骨細胞分化能、細胞死といった動的指標を解析することで、骨芽細胞がいかにして、骨形成が必要な状況を感知し骨形成を行うのかを明らかにし、骨形成を促す骨芽細胞の生着性の高い新たなインプラント表面の形状、およびコート素材を開発する。

我々がその存在を予想していたIRBITを介した細胞内HCO3-濃度（細胞内pH）と細胞内Ca2+動態との連関した調節機構が、生体内、特に中枢神経系シナプス周囲を被覆するグリア細胞の突起部分で働いている可能性が示唆された。IP3受容体に高親和性に結合するHP-IRBITのリン酸化を担う酵素とそのリン酸化部位は同定できたが、IP3受容体に高親和性を示す真のHP-IRBITには、未だ同定されていない修飾反応の存在が示唆された。今後は、IRBITのグリア細胞における細胞内pHと細胞内Ca2+の連関的制御機構が、シナプス伝達、及び脳機能にどういう役割を果たしているかを、明らかにして行きたい。

IRBITによるCaMKIIα活性制御の分子機構およびその生理的意義を明らかにし、脳神経系におけるIRBITの役割を解明するため、in vitro kinase assay,細胞株発現系、培養神経細胞およびIRBITを全身で欠損したIRBIT KOマウスを用いてIRBITがCaMKIIα活性に及ぼす効果を検討した。いずれの実験系においてもIRBITがCaMKIIα活性を抑制する事を明らかにした。さらにIRBIT KOマウスが学習行動試験や社会性行動試験等の行動実験において行動異常を示す事を明らかにした。

新規IRBIT結合蛋白質として同定したAnion Exchanger 2/3 (AE2/3)へのIRBITおよびLongIRBITスプライシングバリアントの結合および活性制御への寄与について解析を進めた結果、IRBITおよびLongIRBITのスプライシングバリアント(IRBIT ファミリー)は、AE2/3に対して異なる結合親和性を示す事を見出した。さらに、AE3部分欠損蛋白質を発現するコンストラクトを作成し、細胞株を用いた共免疫沈降法により解析した結果、IRBITファミリー結合部位がAE3のN末端細胞内部位の複数の領域にわたる事が分かった。このことは、IRBITファミリーとAE3が立体的な結合面を形成していると考えられ、IRBITファミリーとAE3の比較的強固な結合の理由と推測される。また、IRBITファミリーの中でAE3に対して最も親和性の高いLongIRBIT バリアント3 (LongV3)は、過剰発現によりAE3の細胞内局在に影響を与え、細胞表面に存在するAE3の量を減少させる事を表面ビオチン化法により明らかにした。また、細胞内部に取り込まれたAE3とLongV3の複合体は、初期エンドソームのマーカーと共局在することがわかった。さらに、LongV3の過剰発現系と細胞内pH イメージおよび細胞内塩素イオンイメージングにより、LongV3の過剰発現が、AE3の活性を有意に低下させる事がわかった。これらの結果から、LongV3はAE3細胞内局在制御を介してAE3の活性調節に寄与する事を明らかにした。また、東京大学神経ネットワーク分野との共同研究により、IRBITノックアウトマウスの電気生理学的解析を進めた結果、特定の条件下においてIRBITノックアウトマウスは僅かだが、有意に長期可塑性に異常がある事を、明らかにした。 IRBITファミリーによるAE2/3の活性への影響および制御機構について、結論付けるに十分な結果を得ることができた。また、IRBITノックアウトマウスの電気生理学的解析に関しても解析を終了し、IRBITノックアウトマウスにおける異常を見出すに至った。現在、これまでの研究結果をまとめて論文を準備中である。さらに、新たなIRBITファミリーの結合蛋白質として、異なる制御機構の塩素イオンチャンネルを同定しており、これについても最終年度で解析を進める予定である。 IRBITファミリーの新規相互作用分子として同定した塩素イオンチャネルに関して、IRBITファミリー発現の効果を検討する。さらに、IRBITおよびLongIRBITノックアウトマウス由来の海馬神経細胞を用いて、細胞内塩素イオン動態をFRETを用いたイメージにより解析を進める。また、IRBITおよびLongIRBITダブルノックアウトマウスの胎児は胎生致死であり、発生段階における奇形を示すことを見出したので、その原因となる分子機構解明を試みる。

IRBITノックアウトマウスにおいて見られる種々の行動異常の発症機構を解明するため、モノアミン産生および細胞内pH制御へのIRBITの寄与に関して検討を行った。その結果、モノアミン産生の鍵となるTyrosine hydroxylaseのリン酸化をCaMKIIαの活性を介してIRBITが制御している事がわかった。また、神経細胞およびグリア細胞においてIRBIT欠失が細胞内pH制御の機能異常を引き起こす事も明らかにした。

中枢神経系の興奮性シナプスを包囲するアストロサイトの突起先端部分には、脳特異的なSLC4A4遺伝子のsplice variant、NBCe1/Cが発現している。本研究では、この特徴的な局在の制御機構を明らかにし、神経伝達および高次脳機能に及ぼす影響を解析すべく、NBCe1/C分子に結合する分子をスクリーニングしたところ、カルシニューリンが結合することを見出した。また、このカルシニューリンのCa2+/CaM phosphatase 活性が、NBCe1/Cの細胞膜移行を調節していることを明らかにした。