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変異型の銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）は家族性の筋萎縮性側索硬化症（ALS）の病因タンパク質であり、運動ニューロンにおいて凝集し封入体を形成することが知られている。SOD1の凝集メカニズムについては多くの研究がなされているものの、いまだに解明がなされていない。本課題では、ALSが加齢性疾患の一つであり酸化ストレスの亢進が報告されていることに着目し、酸化的環境におけるSOD1の構造変化を明らかにすることで、ALSにおけるSOD1凝集の病理学的役割について理解することを目的としている。実際、ALS患者の脳脊髄液に含まれるSOD1は、タンパク質表面に露出しているCys111の側鎖が酸化されていることを報告してきた。そこで本年度には、SOD1に過酸化水素を添加することによって、Cys111の酸化を試験管内で再現することを試み、Cys111の酸化がSOD1の構造に及ぼす影響について検討を進めた。まず、高濃度の過酸化水素を添加することによって、Cys111の側鎖がスルフェン酸・スルホン酸に酸化されることを質量分析によって明らかにした。また、Cys111の側鎖がスルフェン酸に酸化されたSOD1を模倣したC111D変異型SOD1を作製し、熱安定性や亜鉛イオンとの結合親和性について評価した。特に、C111D変異によってSOD1の熱安定性が若干ではあるが低下することがわかったものの、生理的温度においてタンパク質のミスフォールディングが引き起こされるほどの安定性低下ではなかった。しかし、過酸化水素で酸化したSOD1は疎水性度が増大しており、変性していることが示唆されたことから、酸化によるSOD1の変性メカニズムについてさらに検討を進めている。

変異型の銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）は、遺伝性の筋萎縮性側索硬化症（ALS）の発症原因として考えられており、運動ニューロン内に変異型SOD1が凝集して封入体を形成していることが知られている。アミノ酸置換による変異型SOD1の凝集メカニズムとして、ホモ二量体として存在するSOD1の単量体化が引き金となって凝集し、運動ニューロンに毒性を発揮しているのではないかという提案がある。しかし、SOD1ホモ二量体の解離定数は非常に小さく、単量体化するのはごく一部であることから、その検出が極めて困難であった。そこで、京都府立大学の田中俊一准教授と協力し、単量体SOD1に特異的に結合する人工タンパク質（モノボディー）を開発した。本課題で開発したモノボディーMb(S4)は、正常なSOD1ホモ二量体とは結合せず、単量体化したSOD1のみと結合する高い選択性を持っている点が大きな特徴である。一方で、開発したモノボディーと単量体型SOD1との親和性は低く、プルダウン法などの手法によって単量体型SOD1の検出を行うことはできなかったものの、クロスリンク試薬を活用することで、モノボディー・単量体型SOD1の複合体を検出することができた。実際、変異型SOD1を発現させた培養細胞や出芽酵母・大腸菌から、単量体SOD1を検出することにも成功した。以上より、親和性に課題が残っているものの、単量体型SOD1のみを特異的に認識することができる分子の開発に成功した。

SOD1遺伝子変異を原因とする筋萎縮性側索硬化症（SOD1-ALS）では、ミスフォールド型の変異SOD1タンパク質が病変部位である脊髄運動ニューロンに異常に蓄積する。しかし、ミスフォールド型SOD1の分子構造的特徴や毒性については明らかとなっていない。私たちはこれまでに、変異SOD1がジスルフィド結合でクロスリンクされた「S-Sオリゴマー」が疾患の発症に関わるミスフォールド型SOD1であることを報告してきた（PNAS 2006; JBC 2013）。本研究では、S-Sオリゴマーを特異的に認識する抗体の開発に成功し、病変部位である脊髄前角の運動ニューロンにS-Sオリゴマーが加齢に伴い蓄積することを見いだした（Mol Neurodegener 2017）。一方で、SOD1-ALSの非病変部位である小脳には、S-Sオリゴマーの形成・蓄積は認められなかった。また、SOD1遺伝子に変異を有するALS患者の脊髄には、本課題にて開発したS-Sオリゴマー特異的認識抗体によって検出されるSOD1が蓄積していることを見いだした。よって、病因性変異に伴って、SOD1の構造が不安定化することで、S-S結合の組換え現象が生じ、S-Sオリゴマーが形成することを示すことができた。しかし、S-Sオリゴマーが神経変性に関わる毒性を発揮するのかについては未だ不明のままである。そこで本研究では、S-Sオリゴマーを線虫に投与することでその毒性の評価を行った。その結果、S-Sオリゴマーを添加すると寿命短縮・運動性低下が見られたのに対して、正常型SOD1を投与しても毒性は確認されなかった。以上より、変異SOD1タンパク質はS-Sオリゴマーを形成することで病原性を発揮することを提案する。

A zinc ion plays essential roles in keeping our lives healthy by stabilizing the native structures of proteins and/or by functioning as an active site for enzymatic reactions. A zinc ion has also a high capability to form a complex with various kinds of ligands and can thus bind at the binding site for the other metal ions such as iron and copper ions in proteins. Such a "mis-metallation" can further reduce or even negate the enzymatic activity of metalloproteins. Actually, intracellular zinc ions exist as complexes with biomolecules, and almost no "free" zinc ions has been proposed to exist in a cell. In such a intracellular environment, we still do not know how Zn-binding proteins acquire zinc ions. In this study, we have challenged the identification of "Zn chaperone" proteins that can deliver a zinc ion to Zn-requiring proteins.

ALS-causing mutations facilitate aggregation of SOD1, upon which significant structural changes of SOD1 have been assumed; however, a structure of protein aggregate remains obscure. Here, by utilizing mass spectrometry, I have identified a protease-resistant core in wild-type as well as ALS-causing mutant SOD1 aggregates. SOD1 aggregates exhibit mutation-dependent structural polymorphism, which further regulates biochemical properties of aggregates such as solubility. Based upon these results, I propose a new pathomechanism of fALS in which mutation-dependent structural polymorphism of SOD1 aggregates can affect disease phenotypes.

A copper ion is one of the metal ions essential for our life and often functions as an active center of enzymatic reactions in various proteins. Despite this, a free copper ion can be toxic because of its high redox activity that catalytically produces reactive oxygen species. Intracellular copper ions are hence necessary to be well regulated in terms of their localization and amounts. In this study, I have focused upon the intracellular pathway for transferring a copper ion to the copper-containing enzyme, SOD1. An extracellular copper ion has been known to enter into the cell via a copper transporter, CTR1; a copper chaperone, CCS, then delivers the copper ion to SOD1. The ultimate goal of this study is to reconstitute the copper transfer system in a test tube by using CTR1, CCS, and SOD1.

Copper ion is essential to various physiologies. Most of the copper ions in our bodies exist as the protein-bound form and function as active sites for enzymatic reactions. Also, the level of copper ions in our bodies is strictly controlled, and even slight deviation of the copper ions in physiological conditions will lead to pathological conditions and sometimes fatal diseases. Here, we investigated the mechanism regulating the acquisition of copper ions by intracellular proteins and also examined the molecular pathomechanism of the disease caused by the mis-regulation of copper metabolism in the cell. More precisely, we have noted the activation mechanism of Cu,Zn-superoxide dismutase (SOD1), which requires a copper ion for its enzymatic activity. Also, conformational changes of SOD1 upon dissociation of metal ions have been examined and discussed in relation to the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis.

ハンチントン病(HD)はハンチンチン蛋白質(Htt)に存在するポリグルタミン鎖(polyQ)の異常伸長によって引き起こされ、神経細胞内での変異蛋白質の蓄積・凝集が主な病理学的所見である。本研究では、Htt凝集体に含まれる蛋白質の一つとしてTIA-1を同定し、TIA-1がHtt凝集体に取り込まれるメカニズムとして、polyQ線維によるTIA-1の線維化促進を提案している。TIA-1はRNA結合を行うN末端領域とstress granule形成にかかわるC末端領域(TIA-1^c)からなるが、培養細胞を用いた実験から、polyQ凝集体との共局在にはTIA-1^cが必須であることを明らかにした。線維の形成は「核形成」と「伸長」の二段階からなるが、ある蛋白質の線維が別の蛋白質の線維化の核として働くことが稀にある(cross-seeding)。そこで、polyQにTIA-1^cの線維を加えたものの、polyQの線維化に大きな速度論的変化はなかった。しかし、TIA-1^cにpolyQ線維を加えるとTIA-1^cの線維化が促進されることが分かった。細胞内においても、polyQ凝集体が核となりTIA-1が凝集体に巻き込まれる様子を生細胞観察により捉えることができ、R6/2マウスにおいても、変異Httが凝集した後にTIA-1がSDS不溶性になることを確認できた。以上の結果から、異常伸長したpolyQからなる線維状凝集体が他の蛋白質の線維化を促進していることが示唆される。さらに、polyQ線維を核としたcross-seeding機構により、様々な蛋白質の機能喪失が加速度的に進行すると考えられ、発症すると急速に症状が悪化する神経変性疾患の一面を説明できる可能性がある。

酸化ストレスの増大は、タンパク質などの生体分子に酸化的な修飾を施すことが知られており、様々な疾患で観察される。例えば、神経変性疾患の一種である筋萎縮性側索硬化症（ALS）では、各種の酸化ストレスマーカーが病変部位である脊髄において増大するとともに、銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）の構造異常化（ミスフォールディング）が進行するとされている。実際、精製したSOD1に高濃度（mM）の過酸化水素（H2O2）を添加することでTrp/His/Cysが酸化されることから、酸化修飾によるSOD1のミスフォールディング機構が提案されている。しかし、生体内でのH2O2濃度がmMレベルにまで高くなることがあるのかは甚だ疑問であり、酸化ストレスの増大がSOD1の構造にもたらす影響は明らかとなっていない。そこで、低濃度（microM）のH2O2がSOD1の構造にもたらす影響を検討したところ、タンパク質表面に露出したCys111のチオール基がスルフェニル化されることが確認された。天然状態のSOD1はホモ二量体として存在しているが、スルフェニル化を通じて異常化したSOD1は単量体となり、構造揺らぎが増大したミスフォールド体となっていることも分かった。つまり、生体内で生じるH2O2によって、SOD1はスルフェニル化されうることが十分に考えられ、金属イオンがさらに解離することでミスフォールドすることが考えられた

本研究では、銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1, SodC）の成熟化過程に着目し、生体内における生命金属動態制御の理解と、その破綻がもたらす疾患発症機序の解明を目標としている。その実現に向けて本年度は、バクテリアSodCによる銅イオン獲得のメカニズムとヒトSOD1への銅・亜鉛イオンの結合メカニズムの解明に取り組んだ。まず、SodCによる銅イオン獲得のメカニズムについては、SOD1/SodCに保存された分子内ジスルフィド結合に関わるシステイン残基が、銅イオンや亜鉛イオンの獲得に重要な役割を果たしうることを明らかにできた。また、ヒトSOD1への銅・亜鉛イオン結合プロセスにおいては、分子内ジスルフィド結合が形成していると、銅・亜鉛イオンの結合サイトに金属イオンがランダムに結合してしまうことがわかった。特に、銅イオン結合サイトへの亜鉛イオンの結合を防ぐためには、ジスルフィド結合が切断されている必要があった。以上より、SOD1やSodCへの金属イオン結合は、ジスルフィド結合に形成するシステイン残基によって制御されていることがわかった。これらの成果は、２報の原著論文として報告するとともに、６件の招待講演として発表を行った。

To reveal a molecular mechanism regulating the intracellular transport of copper ions, I have noted specific interactions between a copper chaperone, CCS, and a copper-requiring enzyme, SOD1. Inside cells, a copper-bound form of CCS specifically recognizes apo SOD1 and then delivers a copper ion to SOD1. CCS consists of three domains, among which a central domain(CCS-dII) plays a role in recognizing SOD1. In this study, I have performed in vitro biochemical tests using recombinant CCS-dII and SOD1 proteins and found the requirements for these two proteins to associate with each other.

To understand intracellular dynamics of metal ions (copper ions, in particular), I have focused upon Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1), which is one of the most important copper proteins, as well as the copper chaperone protein CCS that supplies copper ions to SOD1. This study has suggested a new mechanistic action of CCS on SOD1 upon the copper supply and also newly identified a protein interacting with CCS. Furthermore, the breakdown of a copper supplying step to SOD1 was evaluated as a possible pathological change occurring in a neurodegenerative disease, amyotrophic lateral sclerosis (ALS). Misfolded SOD1 that is unable to bind copper ions has been proposed as a pathogenic species causing ALS.

生体内において、銅イオンは様々なタンパク質に結合し、酸化還元活性の中心として機能している。一方、遊離状態の銅イオンは、細胞にとって有毒な活性酸素種を生成することが知られている。そのため、細胞内のほぼ全て銅イオンは何らかの生体分子に結合した状態で存在しており、遊離状態の銅イオンは細胞１つあたりわずか１個程度だと言われている。このような生体内環境において、細胞内に取り込まれた銅イオンは、「銅シャペロン」と呼ばれる銅イオン運搬タンパク質に結合することで、銅イオンを必要とする種々のタンパク質へと供給される。代表的な銅イオン結合タンパク質である銅・亜鉛スーパーオキシドディスムターゼ（SOD1）は、銅イオン、亜鉛イオンを結合し、分子内でS-S結合を形成することで活性化する抗酸化酵素である。SOD1は銅シャペロンCCSから銅イオンの供給を受けることが知られている。実際に、CCS遺伝子を欠損させた酵母やマウスにおいて、SOD1の活性が消失、あるいは、著しく減少することが報告されている。また、生体から抽出したSOD1には銅イオンが１対１で結合していることから、生体内の全てのSOD1がCCSから銅イオンを供給されていることが考えられる。例えば、SOD1に対してCCSと銅イオンをどちらも添加した場合、銅イオンのみを添加した場合に比べて、SOD1の活性が劇的に上昇することが報告されている。しかし、試験管内で活性化したSOD1に関して、酵素活性の定性的な評価は多くなされているものの、CCSによる銅イオンの供給を定量的に評価している報告はほとんどなく、実際にSOD1に結合した銅イオンの量は不明瞭となっている。本研究では、銅イオンのキレート剤であるBCSを利用することで、SOD1に結合した銅イオンを簡便に定量できる手法を確立し、CCSによるSOD1への銅イオン供給反応について定量的な評価を試みた。

Misfolding of mutant Cu/Zn-superoxide dismutase (SOD1) proteins is a pathological hallmark of a neurodegenerative disease, familial amyotrophic lateral sclerosis (fALS). Here, we describe a unique method to detect misfolded SOD1 by using a nematode, Caenorhabditis elegans. A mutant SOD1 protein is known to misfold into either amyloid-like, insoluble aggregates or disulfide-crosslinked, soluble oligomers in vitro. When those misfolded SOD1 proteins in vitro were administered to the worms, we observed adverse effects of the oligomers but not the aggregates on C. elegans such as shortened lifespan, decreased motility, and deteriorated defecation. While a mechanism behind the trapping of worms with the oligomers remains obscure, this study reveals that C. elegans has potential to detect misfolded proteins even in a sub-micromolar concentration.

DNA/RNA結合タンパク質であるFUS（TLS）をコードする遺伝子への変異は、家族性の筋萎縮性側索硬化症の原因として報告されている。さらに、病因性変異はFUSの核内移行シグナルとして機能するC末端領域に数多く同定されており、変異型FUSは細胞質に異常に蓄積することで本来の機能を喪失することが提案されている。しかし、C末端領域以外にも多くの病因性変異が見つかっており、そのような変異型FUSは野生型と同様に核内に局在することから、変異型FUSによるALSの分子病理メカニズムは明らかでない。 そこで、野生型及び各種のALS変異型FUSタンパク質を作製・精製し、その凝集反応を試験管内で比較検討したところ、核内移行シグナルに影響を及ぼさない病因性変異（G156E）はFUSの凝集性を増大させ、アミロイド様の線維を形成することが分かった。また、G156E変異型FUSはヒト神経芽細胞腫SH-SY5Yやラット海馬神経初代培養細胞において、核内で凝集体を形成することを明らかにした。興味深いことに、G156E変異型FUSが核内に凝集体を形成した神経細胞では、MAP2の染色性が低下しており、何らかのダメージを受けていることが示唆された。さらに、G156E変異型FUSが形成する線維はシードとして機能することで、野生型FUSを線維化させることが分かった。実際、核内に形成するG156E変異型FUSの凝集体には、野生型FUSが共局在していることが明らかとなった。 つまり、細胞内局在に影響を及ぼさないアミノ酸変異であっても、FUSの凝集性を増大させる変異が存在することが分かった。そのような変異型FUSが核内で形成する線維状凝集体は、シードとして野生型FUSの線維化を促進することができ、FUSの生理機能を「雪だるま式」に低下させることで、神経細胞死を引き起こすと考えられた。

第1期の公募研究が参画したことから、ホームページを更新、毎月のニュースレター発行を継続、充実させた。前年度構築した連携研究・共同研究の積極的な実施体制を浸透させた。 総括班会議については、COVID-19の感染状況を鑑みてオンライン実施1回、対面とオンラインのハイブリッド実施2回の他、メール会議1回実施した。領域会議は、オンライン実施1回、ハイブリッド実施1回とした。領域会議地方巡業と銘打って、対面とオンラインでのハイブリッド方式での実施を東北大にて準備した（COVID-19感染状況からオンライン実施）。 また、領域の班会議やシンポジウムとは別に、生命金属科学関連分野の若手研究者を集めて「若手会」を設け、若い世代の人的交流を活発にする試みを開始した（3月にオンライン若手会を実施）。また、オンライン実施等となった、生化学会、化学会、薬学会等各種学術集会においても、合計11回のワークショップ、シンポジウムを共催したほか、生命金属に関連する合同年会（ConMetal2021）を共催し、研究成果を国内外に発信した。前年度の研究成果報告書を冊子としてまとめ、生命金属に関連する研究者に送付、御意見を頂き、領域運営に積極的に活用した。また、生命金属研究各領域の魅力について語り、融合研究を加速させるほか、一般社会にも広くアピールするため、IBmSウエブセミナーを領域内で合計12回にわたって実施した。特に公開可能な内容について順次ホームページで公開している。また、班員が中心となって進めている研究の最先端の内容をまとめた動画の作製に着手、領域内での十分な議論を踏まえ、公開を開始した。

ApoEは、アルツハイマー病患者の脳に見られる蛋白質沈着物(老人斑)の構成蛋白質として早くから同定されており、Aβのアミロイド形成を促進することが示唆されてきた。しかし、アルツハイマー病の神経病理がApoE遺伝子型により異なるという報告もあり、ApoEアイソフォームはアミロイドの化学的性質に影響を及ぼす可能性が考えられる。つまり、ApoEはアミロイド形成を制御する重要な蛋白質であると示唆されるが、その詳細な機構に関しては明らかでない。まず、ApoE蛋白質のアイソフォーム(E2,E3,E4)を大腸菌に発現させたところ、全てのアイソフォームにおいて毒性が認められた。そこで、培養温度を下げ緩やかな発現誘導を行うことで、培養液1LあたりmgオーダーでのApoE蛋白質の精製に成功した。一方、大腸菌においてAβペプチド単独ではその発現を認めることができなかったものの、GST蛋白質と融合させることで発現量を増加させ、精製後にプロテアーゼで切断することでAβペプチドを大量に得る手法を開発した。また、再構成Aβペプチドは一定時間後に直径が約10nmの線維状凝集物であるアミロイドを形成することを原子間力顕微鏡により確認した。ApoE蛋白質単独では線維状凝集物の形成を確認できなかったが、ApoE蛋白質はAβペプチドのアミロイド化を遅らせることが分かった。特に、Aβのアミロイド化を遅らせる効果はE3よりもE4の方が弱かったことから、脳内にAβアミロイドが蓄積するまでの時間がApoEの遺伝子型に依存する可能性が考えられた。