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Reactive oxygen species (ROS) are recognized as important signal molecules regulating various biological processes. Low levels of ROS released from mitochondria extend lifespan. We identified a novel mechanism of ROS-mediated lifespan extension by generating fine-tuned ROS level at the plasma membrane through a peroxidase/dual oxidase system in Caenorhabditis elegans. A redox co-factor, pyrroloquinoline quinone (PQQ), activates dual oxidase (DUOX)/BLI-3 to produce the ROS H2O2 at the plasma membrane, which is subsequently degraded by peroxidase/MLT-7 to generate the appropriate levels of ROS. The ROS signal appeared to be mediated by the oxidative stress transcriptional factors SKN-1/Nrf2 and JUN-1. We propose that low levels of ROS, fine-tuned by the peroxidase/dual oxidase system at the plasma membrane, act as second messengers, to extend lifespan by the effect of hormesis.

Using thermotaxis behavior of C. elegans as a model system, we analyzed the relationship between behavioral regulation and neural activities in the neural circuit responsible for thermotaxis. We introduced and evaluated newly developed optogenetic tools to elucidate the mechanism through which a behavior is regulated in the circuit. We constructed reliable assay systems that enable to monitor neural activity and behavior. Our results show the relationship between AFD thermosensory neural activity and behavior, and shed light onto the function of stochastic activity of interneurons AIY and RIA.

線虫は温度勾配上に置かれると、それまでに餌を得ていた温度へ向かって探索しながら移動する（温度走性）。このときトラッキングシステムで温度勾配上を探索している個体の行動を計測すると同時に、蛍光画像で非侵襲に特定の神経活動を計測する。 計測には申請者が開発したトラッキング顕微鏡システムを用い、行動中の線虫を自動的に顕微鏡視野内に捕捉し、神経活動と行動の同時計測を行う。これらのデータを情報量と神経活動の情報伝達に注目して定量的に解析する。また探索行動戦略について数理モデルを構築し、シミュレーション解析を行う。さらにシミュレーション予測に基づいて光遺伝学を用いた検証実験を行う。

本研究では、生体内で起こる少数細胞の分裂制御エラーが、個体発生や機能に及ぼす影響を定量的に明らかにして、細胞分裂異常に起因する病態形成のメカニズムを理解することを目的としている。2020年度は、前年度に作成に成功した光応答性CenpE阻害剤をゼブラフィッシュ初期胚に導入し、同化合物を用いた生体局所分裂障害の導入の実現性を明らかにすることを主な目標とした。化合物が水溶性に比較的乏しいため、投薬条件の特定に、当初予定以上に多くの検証を要した。しかし、最終的に最適処理条件を見出すことに成功し、受精直後からの投薬によって、受精後３時間程度の発生胚から再現性よく、照射光波長依存的に細胞分裂期の染色体運動をon/off制御することに成功した（固定胚を用いた蛍光抗体法および、蛍光ヒストン安定発現系統を用いた生細胞観察により確認した）。さらに、異なる光照射条件下で、同化合物処理胚の発生、生存性を追跡したところ、CenpE活性を阻害する光照射条件下（可視光照射）では、受精後１０時間前後で重篤な発生障害をともなってすべての胚が死滅するのに対し、CenpE活性阻害を解除する照射条件下（UV光照射）においては、すべての胚が、無処理コントロールと差異なく正常な発生を行うことができることを見出した。このことから、同化合物を用いた分裂阻害が、CenpE阻害条件では生体機能を阻害するのに十分に高効率な分裂阻害能をもつ一方で、阻害解除条件では優れた低侵襲性を保っていることが明らかになった。一方で、より多様な細胞分裂の空間制御を実現するために、光学異性化特性の異なる数種の分裂期モータータンパク質の光応答性阻害剤の作成に着手し、そのうちの一部について、培養細胞モデルにおいて、高い時空間分解能で細胞分裂進行をon/off制御できることを見出した。

Animal's searching behavior consists of information processing mechanisms and strategic regulation of behavioral components; the neural basis to regulate searching behavior remains unclear. To understand information processing mechanisms of the neural circuit for searching behavior, we used thermotaxis behavior of Caenorhabditis elegans as a model system. Neural activity of freely moving worm is acquired by our tracking/calcium imaging system, and mathematical analysis identified the response function of a specific type of neuron. Reconstruction of neural activity using the identified response function and input stimulus showed relationship between the neural activity and thermotaxis behavior.

In this study, we aimed to elucidate the principle and significance of centrosome hyperactivation associated with whole-genome duplication (WGD), a cellular abnormality common in 30% of cancers. We found that this phenomenon is caused by an increase in the accumulation of centrosomal proteins resulting from the doubling of the gene dosage of a centrosome scaffolding gene upon WGD. By developing a method to cancel this centrosome hyperactivation artificially, we found that this phenomenon does not play an adaptive role in the proliferation control of WGD cells. However, contrary to our initial expectation, we found that the centrosome hyperactivation made WGD cells more fragile in centrosomal structural homeostatic regulation, suggesting the feasibility of WGD cell-selective suppression through targeting their fragility.

We succeeded in creating a transgenic C. elegans that carries fluorescent labels on synapses and specific neurons with three different fluorescent proteins. We used it to perform laser surgery experiments for cutting an axon along with a specific synaptic position. The effect on neurotransmission was evaluated for each synapse group by performing calcium imaging on these nematodes. We also succeeded in inducing synapse-specific expression of miniSOG, which suppresses synaptic function locally in response to light, and confirmed that light illumination suppresses neurotransmission. Along with the laser surgery experiments, we discovered axonal regeneration in head ganglion neurons and elucidated some of the molecular and cellular mechanisms involved in this process.

本研究では、神経突起などの微細部位でのみカルシウムシグナルが検知できる神経細胞を対象に、個体が自由に動く状況でカルシウムシグナル検出をする手法を開発し、行動中の神経活動と行動を定量的に測定することで、個々の神経活動と行動の関係を直接明らかにすることを目的とした。特に、神経回路における情報処理機構を知る上で鍵となる、線虫のAIY介在神経細胞に注目し、記憶や学習を調べる実験系である温度走性行動中の神経活動記録を目指した。 24年度はこれまでの成果に基づき高速トラッキングシステムの改良を行い、特に自動焦点合わせの精度と安定性を向上させ、それらを効果的に利用する応用実験方法を確立した。動く対象物を顕微鏡で観察する場合、高倍率になると対象を捕捉するための高速な制御と焦点合わせが問題となる。高速な制御はこれまの成果により実現できていたが、焦点合わせについては実現されていなかった。分岐させた顕微鏡光路と３台の高速カメラを使って、異なる焦点面から同時に画像取得を行い、その画像を使って焦点制御を行うシステムを開発した。さらに、AIY介在神経細胞で高感度のカルシウムプローブGEM-GECOを発現させ、蛍光イメージングを行った。動く対象におけるカルシウムイメージングでは動きによるノイズの影響を排除するため、蛍光プローブの感度の高さが非常に重要である。高感度のカルシウムプローブを実用化することで信頼性の高いカルシウムイメージングデータを取得できるようになった。これらの開発した機器、試料を用い、温度勾配を寒天プレート上に形成する装置と組み合わせることで、温度勾配上を自由に行動している線虫を高倍率で追尾しながら蛍光イメージングすることに成功した。このように、機能や動作機構を調べることが難しい介在神経細胞に対して信頼できる実験系を設立することができた。 24年度が最終年度であるため、記入しない。 24年度が最終年度であるため、記入しない。

We have developed a tracking system that automatically tracks microorganisms navigating freely on a small dish. The system succeeded in tracking nematodes acting freely on the temperature gradient under a high magnification objective lens. Fluorescence calcium probes were expressed in specific neurons and neural activity was measured with this system in noninvasive manner under a freely behaving condition. To analyze the time-lapse imaging data obtained from this tracking system, an image analysis program was developed. Using these tools, we analyzed behavioral factors and neural activities related to thermotaxis behavior. Our research helps to understand how activity of interneurons contributes to regulate behavior during exploratory navigation.

We focused on an inter-neuronal circuit that regulates behavioral mode of animals. Comprehensive analysis including time courses of behavior and neural activity showed elements of behavior to explore and navigate animals on thermal environments. Mathematical analysis clarifies quantitative data so that we could identify functional neural circuits for the behavioral regulation. We also established quantitative perturbation methods for neural activity analysis and successfully determined some states of the target neural circuit.