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キメラ抗原受容体（CAR）導入NK細胞は、造血器腫瘍に対しては臨床試験で有望な結果が報告されているものの、標準的な製造プロトコール、基本的な安全性、治療効果についてのデータは十分ではない。従来の理解と異なり、NK細胞にもT細胞に類似したメモリー様状態が存在し、その背景にある遺伝子発現、エピゲノムプロファイルの変化が明らかとなってきた。そこで本研究ではNK細胞のメモリー形成に中心的に関わる転写ネットワーク、エピジェネティックプロファイルを特定の遺伝子改変により再現することで、長期生存能・持続的な治療効果を誘導できるCAR-NK細胞療法を開発することを目標とした。 本年度は、CAR-NK細胞に長期生存能を付与する遺伝子改変方法の探索を進め、有望な遺伝子標的を同定することに注力した。健常人由来末梢血単核球、または臍帯血細胞よりCD56陽性NK細胞を単離した上で、解析に用いた。特にNK細胞が終末分化状態に至る過程で発現変化を来す遺伝子に着目して、それらの遺伝子の過剰発現、及びCRISPR/Cas9によるノックアウトを行った際の既往変化をin vitroで解析した。その結果、遺伝子Aのノックアウトにより、NK細胞の長期的増殖能が顕著に向上することを見出した。細胞傷害活性には大きな変化がなかった。遺伝子AノックアウトCAR-NK細胞は、マスサイトメトリー解析においても広範な細胞表面抗原の発現変化を示し、またRNAシークエンスにおいてもコントロールＮＫ細胞と比較して1500個程度の遺伝子で有意な発現変化が確認された。 次年度以降は遺伝子ＡノックアウトCAR-NK細胞の持続的抗腫瘍効果をin vivoにおける実験系で評価する計画である。

本研究は急性骨髄性白血病(AML)発症とNF-κB経路活性化との関連を明らかにし、特に白血病幹細胞(LSC)における同経路の活性を調べ、その活性化機序、NF-κB経路活性阻害がAML発症抑制・治療に与える効果を解析することである。昨年度までに3種類の白血病マウスモデル(MLL-EM,MOZ-TIF2、BCR-ABL+Nup98-HoxA9導入白血病)のLSCでNF-κBの核内移行の亢進を確認し、またNF-κBの抑制がin vivoにおいて白血病進行を著しく抑制すること、TNF-αのautocrine作用が恒常的活性維持に重要であることを示した。今年度は白血病細胞におけるTNF-αの発現をshRNAの導入により抑制し、in vivoにおいて白血病の進行が抑制されることを確認した。またLSC,non-LSCにおいてNF-κBの活性が異なる機序として、プロテアソームの活性に注目し、LSCにおけるプロテアソームの高い活性が、IκBαの分解亢進、それに伴うNF-κBの核内移行の亢進につながることを明らかにした。これに加え、proteasome inhibitorの白血病発症マウスへの投与がLSC分画を特異的に減らすことを示し、同機構の治療標的としての重要性を示した。また逆に、IκBαに対するshRNAを導入し、NF-κBの活性を強制的に亢進させた場合、白血病細胞中のLSC fractionの割合が増加することを確認し、LSCの増殖における同経路の重要性を多角的に証明した。最後にAML患者検体を用いて、LSCに富むCD34+CD38-分画におけるNF-κBの活性、TNF分泌能を調べ、コントロールと比較しほとんどの症例で両者とも亢進していることを確認した。患者検体での同様のデータを得られたことは、実際の臨床応用を目指す上で非常に意義が大きいと考えられる。

The overarching goal of this study is to enhance therapeutic efficacy of adoptive cancer immunotherapy, in which tumor antigen-specific T cells are prepared in vitro and infused into a patient. To suppress T cell exhaustion and provide long-lived potential in antitumor T cells, we developed an artificial receptor that blocks PD1 signaling as well as activates cytokine signaling. The artificial receptor-expressing chimeric antigen receptor (CAR)-engineered T cells showed increased STAT5 phosphorylation and accomplished superior proliferation upon antigen stimulation. Moreover, the artificial receptor-transduced CAR-T cells produced more cytokines when cultured with PDL1-positive tumor cells. These results demonstrate that the newly developed receptor provides T cells with resistance to exhaustion and long-surviving capacity.

キメラ抗原受容体（CAR）導入T細胞は抗原特異的で高い細胞傷害効果を有するが、がん組織内における疲弊誘導などでそのエフェクター効果が減弱すること、及びがん細胞側の標的抗原の喪失などによる免疫逃避機構が働くことが問題である。 本研究ではCARを通じたエフェクター効果のみならず、CAR-T細胞から、例えば二重特異性抗体などの抗体医薬品を遺伝子レベルで製造・分泌させることで、さらに細胞傷害効果を高めることを目指している。今年度は特定の標的抗原に注目して、分泌に用いる抗体の遺伝子配列について、主にシグナルペプチド、リンカー配列の検討を行った。標的抗原を発現するがん細胞株との共培養の実験系で、がん細胞に対する細胞傷害効果の誘導、培養上清中への薬剤の分泌濃度などの観点から、適した配列を決定した。同分子は抗原を発現しない細胞には作用せず、抗原特異性が付与されていることを確認した。また次年度以降に用いるマウス腫瘍モデルの確立を行った。免疫不全マウス（NSGマウス）に腫瘍細胞株を投与した上で、ヒトCAR-T細胞を輸注する実験系で、腫瘍の増生を抑制できることを確認した。さらに腫瘍量やCART細胞の投与量を調整してCART細胞のみでは腫瘍増生を制御できないプロトコールを設定した。 次年度以降は複数の標的抗原を検討しながら、in vivoにおけるマウス腫瘍モデルで本治療システムが通常のCAR-T細胞と比較して優れた抗腫瘍効果を誘導できることを示す。同時に他臓器に対する毒性などを検証することで、特異性（安全性）の確認を行う。

本研究では、抗腫瘍T細胞の長期生存能を高めるために、T細胞性リンパ腫細胞で変異が報告されている遺伝子群に着目して抗腫瘍T細胞に遺伝子導入を行い、その機能解析、具体的には細胞増殖能、サイトカイン分泌、細胞傷害活性などの評価を通じて、持続的な抗腫瘍効果の改善に寄与する遺伝子修飾標的を同定することを目標としている。 本年度は、これまでの探索から同定していたがん抑制遺伝子PRDM1のノックアウトによるキメラ抗原受容体(CAR)-T細胞、及び腫瘍浸潤T細胞 (TIL)の機能改善について、さらに解析を進めた。PRDM1をCRISPR/Cas9技術を用いて遺伝子レベルでノックアウトしたCAR-T細胞は、コントロールと比較して生体内における長期生存能に優れ、その結果として有意に治療効果を改善させることを、異なる標的抗原を標的とした複数のマウス腫瘍モデルにおいて示した。特に現在のところ有効な治療効果が得られていない固形がんに対するCAR-T細胞においても、同様に長期生存能の獲得が見られることを示した。その際に、生体内に残存するPRDM1ノックアウトCAR-T細胞が未分化メモリー形質を有意に維持していることも確認した。またTILについては、主に肺癌、婦人科腫瘍検体から採取した検体について、PRDM1ノックアウトの効果を検証した。いずれの検体でも末梢血T細胞と比較して終末分化がより進行していたが、PRDM1ノックアウトにより、一部のメモリー形質の再獲得が起こり、サイトカイン分泌能が改善することを確認した。これらの研究成果は学術論文として受理された (Yoshikawa et al. Blood 2022)。

In the present study, we aimed to elucidate the pathogenesis of myeloproliferative neoplasm (MPN), one of the major hematological malignancies. We focused on JAK2V617F mutation frequently seen in MPN and analyzed its contribution to the incidence of MPN and the transformation of MPN into acute myelogenous leukemia (AML). We found that MPN cells abundantly secreted lipocalin-2. First, lipocalin-2 induced DNA damage in the neightbouring normal hematopoietic cells within MPN bone marrow in a paracrine manner, which could contribute to the progression of MPN into AML through accumulation of the genetic mutation. Moreover, we showed that lipocalin-2 suppressed normal hematopoiesis through inducing the DNA damage-induced apoptosis. Since proliferation of MPN clones were not affected by lipocalin-2, lipocalin-2 secretion resulted in the relative growth advantage of MPN clones over normal hematopoietic cells, which promoted the development of MPN.