Research projects

本研究では、「がん関連転写因子FOXO3aをめぐるDNAと14-3-3ζの拮抗メカニズムの解明」、「孤発性ALSの原因タンパク質であるTDP-43の細胞内凝集・沈殿と、RNA結合によるその阻害のメカニズムの解明」を実施例として、複合体の立体構造や解離定数だけからでは説明のつかない効率性の高い拮抗メカニズムを解明することを目的とする。さらに明らかにしたメカニズムに基づき、これらの相互作用系が密接に関わるがんとALSに対する創薬戦略を構築し、新規薬剤の創製に貢献していく。

我々は、胆汁酸誘導体の一つであるINT-767がHBVのエンベロープ蛋白質の疎水性領域に結合してHBVの感染を強力に阻害することを発見した（Ito K et al. Hepatology. 2021）。本研究によりHBVの肝細胞内への侵入機構を分子レベルで解明し、胆汁酸誘導体や低分子化合物を利用して、より有効性および安全性が高い新たな感染阻害剤を開発する。HBVと同様に新型コロナウイルスやヒト免疫不全ウイルスなどのエンベロープウイルスもエンベロープ蛋白質の疎水性領域を利用して細胞膜やエンドソーム膜と融合して感染が成立するため、本研究成果は他のエンベロープウイルスに対する治療薬開発にも繋がる。

電位依存性イオンチャネル(VGIC)は、神経伝達や心臓の拍動を担う膜タンパク質であり、創薬の標的としても重要である。VGICは一般に、膜電位に応じた構造変化によりイオン透過ゲートを開閉し、特定のイオンを膜透過させることで膜電位を制御する。しかしながら、これまではその構造遷移メカニズムは不明であった。 そこで本研究では、リガンドの結合や化学修飾により未解明である機能構造を安定化して構造解析を実現可能とする手法を確立し、その立体構造をX線結晶構造解析あるいは電子顕微鏡により原子レベルで明らかにするとともに、NMRによりそれらの間の構造遷移を解析することにより、VGICの動作メカニズムを解明する。

B型肝炎ウイルス(HBV) 外殻膜の表面抗原タンパク質（LHBs）は、肝細胞への感染時には肝細胞膜上のタンパク質であるNTCPと結合し、宿主内での増殖時にはHBVのキャプシドを形成するタンパク質であるCpと結合する。そこで本研究は、LHBs―NTCPおよびLHBs―Cpの相互作用様式を原子分解能で明らかにすることで、HBVの肝細胞侵入・増殖メカニズムを解明する。明らかにした立体構造に基づくin silicoスクリーニング、および得られた候補化合物のin vitroアッセイを行うことで、これらのタンパク質－タンパク質相互作用を阻害する中分子合成化合物を探索し、新規作用機序の抗HBV薬を創製する。

膜タンパク質の構造・機能は、しばしば脂質二重層内の微量脂質により調節される。近年、その微量脂質による機能調節には、極性の高い官能基を有するヘッドグループだけでなく、疎水性の高いアシル基の鎖長や不飽和度も含めた脂質分子全体の化学的性質・化学構造によって担われることが分かってきた。しかし、アシル基部分と膜タンパク質との相互作用様式や機能調節メカニズムについては依然として不明な点が多く、構造生物学的手法による原子レベルでの解明が待たれている。そこで本研究では、電位依存性H+チャネルVSOP/Hv1 と調節因子であるアラキドン酸類との相互作用系、および、細胞の形態変化に重要な役割を果たすタンパク質Xと不飽和脂肪酸（PUFA)含有PIP2 の相互作用系を解析対象とし、脂質二重膜中での解析を可能とする独自の試料調製法であるナノディスクを活用したNMR による膜タンパク質とリポクオリティとの相互作用解析法を確立することを目的とする。 本年度は、調製したVSOP/Hv1が単量体と二量体の間の平衡にあり、両者を分離・精製する手法を確立した。等温滴定型カロリメトリーによりアラキドン酸との相互作用解析を行ったところ、相互作用に伴う熱量変化が観測されたのは二量体だけであり、解離定数と結合のストイキオメトリーを求めることに成功した。 またタンパク質Xについては、主鎖アミド基のNMRシグナルの帰属を完了した。常磁性スピンラベルを施したのPUFA含有ナノディスク調製法を確立し、タンパク質Xとの相互作用を、化学シフト変化および常磁性緩和促進効果により解析し、タンパク質X上のPUFA結合部位を同定した。この領域に変異導入したタンパク質Xを細胞上に発現したところ、野生型で見られていた細胞形態の変化が見られなかったことから、タンパク質XとPUFAの相互作用が正常な細胞形態形成に重要であることを明らかにした。 令和元年度が最終年度であるため、記入しない。 令和元年度が最終年度であるため、記入しない。

Voltage-gated ion channels (VGICs) are membrane proteins in charge of neural transmission and heart beats, which are important targets such as arrhythmia. The VGICs sense the changes of the membrane potential by its voltage-sensing domains (VSD), whose conformational changes allosterically regulates the ion-gate opening and closing. However, its mechanism has been elusive. We prepared hERG K+ ion channel and its specific toxin that binds to the VSD of hERG, and identified their interacting residues that are important the functional regulation of hERG. This study provides molecular basis of the channel inhibition and allosteric regulation of the hERG activity.

Aim of this study was to obtain structural basis for hepatocyte specific entry and replication mechanism of hepatitis B virus (HBV), for the treatment of HBV infection. NTCP, an HBV receptor specifically expressed in hepatocyte, was prepared using cell-free protein synthesis system and the preS1-binding activity was successfully confirmed. We also exhibited that preS2 region of HBV large surface protein is important for binding to capsid, which might be important for enveloping of HBV during replication.

多くのがん細胞においては、Ras タンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する、というリン酸化シグナルが亢進している。そのシグナルを持続させる機能をもつタンパク質が14-3-3タンパク質である。本研究では、この14-3-3タンパク質がいかにしてリン酸化シグナルを持続させるのかを定量的に、かつ、タンパク質の立体構造の観点より解明することにより、この過程を数理モデル化して理解することを目的としている。このメカニズムが解明できれば、リン酸化シグナルを抑制する革新的な制がん剤の創製につながると考えている。 多くのがん細胞においては、遺伝子変異によるRas タンパク質の活性化を起源として、その下流にあるキナーゼを活性化し、そのキナーゼは連鎖的に別のキナーゼをリン酸化・活性化する。このようなリン酸化シグナルの連鎖と増幅が、がん細胞の増殖能や浸潤能を高める。 Ser/Thr のリン酸化によるキナーゼの活性化は、14-3-3ζ の結合により持続・亢進し、14-3-3ζ の結合阻害により抑制されることが分かってきた。したがって、がんにおけるリン酸化シグナルの数理モデルを確立するためには、14-3-3ζ と各キナーゼの結合親和性や、その基盤となる複合体の立体構造を明らかにする必要がある。そこで本研究は、14-3-3ζの結合により活性化されるキナーゼや転写因子など（14-3-3ζのclientタンパク質）の全長、あるいは、14-3-3ζとの相互作用部位全体を用いた結合親和性の定量的解析、両者の複合体のX線結晶構造解析を行うことにより、リン酸化シグナルの数理モデルを構築する上での熱力学的・構造生物学的基盤を確立することを目的とする。 本年度は、14-3-3ζのclientタンパク質のうち、キナーゼ3種類、転写因子2種類の大量発現系を構築し、大腸菌をホストとした大量発現・精製を試みた。これまでに、キナーゼおよび転写因子の各1種類について、大量発現・精製法確立に成功した。キナーゼについてはサイズ排除クロマトグラフィーにより多量体状態の解析を行い、単量体～2量体で存在することが分かった。現在、酵素処理によるリン酸化条件を検討している。転写因子については、これを基質とする別のリン酸化酵素によるリン酸化に成功した。GST融合14-3-3ζを用いたグルタチオンセファロースによるプルダウンアッセイにより、14-3-3ζとリン酸化した転写因子の高親和性結合を確認した。 当初の計画は、以下の通りであった。 (1) 14-3-3ζのclient タンパク質の大量調製法の確立、性状解析・活性確認 (2) 14-3-3ζとclient タンパク質全長（相互作用部位全体）の結合親和性の定量解析 (3) 14-3-3ζとclient タンパク質全長（相互作用部位全体）の複合体の結晶化 (4) 14-3-3ζと阻害剤BA およびUTKO1 との相互作用解析、複合体の立体構造解析 これまでに、(1)については、転写因子およびタンパク質キナーゼの大量調製に成功し、特に転写因子についてはリン酸化方法を確立し、プルダウンアッセイによりリン酸化の有無による14-3-3ζとの結合親和性の変化の検出に成功した。(2)、(3)への取り組みを開始したところである。(4)については、未着手である。 当初の計画の(2)、(3)については、結晶化に成功し次第、X線結晶構造解析を行う。 また、大量調製法が確立できていない転写因子とタンパク質リン酸化酵素については、発現条件の検討を行う。