Research projects

Auditory ossicles in the middle ear, bony labyrinth of the inner ear, distal humerus, and distal tibia are highly mineralized in the adult mouse skeleton. In these hypermineralized bone, we found that a new osteoblast subtype that is negative for a conventional osteoblast-marker, Col1a1 2.3kb-promoter. Since osteoblasts in a hearing-related bone, but neither in a distal humerus nor distal tibia, produce type II collagen as a bone matrix, we propose that these type II collagen-positive osteoblasts be designated “auditory osteoblasts”. Bone formed by auditory osteoblasts exhibits not only greater mineral density but a higher degree of apatite orientation than that found in conventional osteoblasts. These data collectively suggest that auditory osteoblasts may optimize the bone material properties for sound transmission.

骨吸収を担う破骨細胞と骨形成を担う骨芽細胞が皮質骨を挟んで存在し、互いに協調して機能することで骨形態を変化させる「トランスペアリング」が、哺乳動物の骨格形成において、骨の種類や動物種を超えて普遍性を持つ現象であるか、を調べる。 本研究では、成長期のマウスおよびオステオン構造を持つ中大動物の肋骨を用いて、トランスペアリングにより誘導される皮質骨の微細構造や形態の変化を解析するとともに、その制御機構の一端として末梢神経系の役割を明らかにすることを目指す。

The significance of high bone density in the bones around the ear is evidenced by the hypermineralization of hearing-related bones in many mammals and by the association of osteogenesis imperfecta, abnormal bone formation diseases, with hearing loss. The analysis of the hearing-related bone of adult mice revealed that osteoblasts localize perivascularly in a pericyte-like morphology, that an intra-osteal vascular network is developed, and that areas of high bone density are localized in the perivascular area and the tympanic membrane attachment site. Furthermore, the expression of genes associated with angiogenesis, calcification, and cell proliferation were elevated in auditory osteoblasts in comparison with conventional osteoblasts. These results indicate that the auditory organ exhibits a characteristic bone metabolism and forms hypermineralized bone.

内耳性難聴の治療薬開発において、薬物の内耳に到達量、「薬物が内耳窓膜や血液迷路関門といったバリアを十分通過しているか」は重要な課題である。内耳への薬物投与経路には内耳膜を経由した局所投与、血液迷路関門（血管条）を経由した全身投与、と前述の２つの併用投与がある。我々は、同時併用投与では各単一経路の投与の総和以上に薬物が内耳に到達する“相乗効果”がみられることを示したが、そのメカニズムは不明である。 具体的には以下３点を解明する。 ①全身投与と局所投与の併用による相乗効果の検証 ②内耳障害における内耳窓膜・内耳血管条の変化と薬物動態の解析 ③内耳バリア機構をターゲットとしたドラッグデリバリーシステムの構築

Abundant glycoproteins exist in bone resorption pits, whereas their physiological roles remain unknown. In this study, I observed that glycoproteins sticking to the surface of resorption pits were produced by mature osteoclasts, but not osteoclast precursors. I also found a novel lectin that tightly bound to a bone reporption pit by lectin microarray analysis, and this lectin specifically recognized osteoclasts and blood vessels in vivo. Matrix metalloproteinase was identified as a major protein that bound to the lectin in those mature osteoclast secreted. Finally, the osteoblast culture experiment suggested the possibility that bone resorption pits could modulate osteoblast migration.

Auditory ossicles in the middle ear and bony labyrinth of the inner ear are highly mineralized in adult mammals. Cellular mechanisms underlying formation of dense bone during development are unknown. Here, we found that osteoblast-like cells synthesizing highly mineralized hearing-related bones produce both type I and type II collagens as the bone matrix, while conventional osteoblasts and chondrocytes primarily produce type I and type II collagens, respectively. Furthermore, these osteoblast-like cells were not labeled in a "conventional osteoblast"-specific green fluorescent protein mouse line. Type II collagen-producing osteoblast-like cells were not chondrocytes as they express osteocalcin, localize along alizarin-labeled osteoid, and form osteocyte lacunae and canaliculi. Therefore, we conclude that these type II collagen-producing hypermineralizing osteoblasts (named auditory osteoblasts) represent a new osteoblast subtype.

By analysis of osteoclasts derived from IRBIT knockout mice, we found that the number of RANKL-induced Ca^<2+> oscillation positive cells was increased in IRBIT knockout mononuclear osteoclasts and that IRBIT knockout cells enhanced cell-cell fusion step during osteoclastogenesis as compared with wild-type cells. These results indicate that IRBIT negatively regulates IP_3R-mediated Ca^<2+> signaling and cell-cell fusion step during osteoclast differentiation.

申請者はIP3R結合タンパク質の一つであるIRBITをノックダウンすると破骨細胞分化因子RANKLによって誘導されるカルシウムオシレーションの始まるタイミングが早まる傾向があることを見いだした。この結果より、IRBITが破骨細胞分化誘導時のカルシウム動態に深く関わっている分子であることが明らかとなった。そこで、破骨細胞分化時、および未分化時にそれぞれ特異的にIRBITに結合するタンパク質のスクリーニングを行い、現在はその中の候補タンパク質の一つであるE3ユビキチンリガーゼに注目し、研究を進めている。

動物の骨格の左右対称性は、歩行や走行、遊泳、飛行の基盤となる。「骨格パターン形成の段階」では、骨芽細胞の細胞キラリティ（互いに鏡像の左手型や右手型細胞のこと）と左右対称性形態形成の関係を解明する。次に「骨の変容成長の段階」では、皮質骨が周囲の臓器の変化に応じて吸収され、対面の皮質骨が形成される「内形成性トランスペアリング」が起きるメカニズムを解明し、鏡像的な骨周囲環境で骨格が左右対称になることを示す。

骨格の形状は高度な左右対称形を示す。しかし、骨が左右対称性に形作られる形態形成の細胞機構は何かという学術的問いには答がない。本研究では、左右対称性の骨格形成のメカニズムを解明する。すなわち、①左右で鏡像の、軟骨細胞や骨芽細胞が存在するという細胞キラリティ仮説と、②皮質骨を挟んだ破骨細胞と骨芽細胞の対合メカニズム（トランスカップリング）が存在して骨周囲の臓器組織に応じて骨も左右対称性に変容し成長するというトランスカップリング仮説を検証する。 筋骨格系は、高度に左右対称である。「骨が左右対称性に形作られる形態形成の細胞機構」を解明するために、二つの現象に着目して研究を進めた。一つ目は、胎児期に左右対称性の軟骨原基を骨に置換したり、膜性骨化で直接骨化していく「骨格形成の段階」であり、二つ目は生後に骨化した骨が筋肉などの骨周囲の臓器・組織の成長と同調して一体となって成長しながらその形を改変していく「骨の変容成長の段階」である。すなわち、左右対称性の骨格パターン形成を説明する「細胞キラリティ仮説」と、パターン形成後の骨の左右対称性の変容成長を説明する「トランスペアリング仮説」の検証を目的とした。 【細胞キラリティ仮説】“骨芽細胞には、鏡像の左手型細胞と右手型細胞が存在して、左右対称の骨格を形成する”という「細胞キラリティ仮説」に基づき、培養系で細胞キラリティを計測した。生体内において、正中面を境に細胞レベルで鏡像であれば、左右対称な骨格系の形態形成を容易に説明できる。これまでマウスの初代骨芽細胞を用いて得られたデータからは、骨芽細胞はホモキラル的であり、細胞より大きなスケールで左右対称構造の構築が行われていることが示唆された。 【トランスペアリング仮説】“皮質骨を挟んだ破骨細胞と骨芽細胞の対合メカニズム（トランスペアリング）が存在して、成長過程で左右対称性の周囲組織の形態に応答し、骨が左右対称性に変容しながら成長する”という「トランスペアリング仮説」に基づき、どのように破骨細胞と骨芽細胞が皮質骨の裏表という遠隔でありながらコミュニケーションができているのかというメカニズムを解析した。皮質骨を貫通する管腔構造が、内向きのトランスペアリングで皮質骨内外のコミュニケーションを担っていることを示すデータが得られた。 【細胞キラリティ仮説】これまでのマウス頭蓋骨由来の初代骨芽細胞を用いた解析によると、左右どちらの頭蓋骨から調製した骨芽細胞も、同じ型の細胞キラリティ、つまりホモキラリティを示していた。そこで、骨芽細胞の偏った細胞キラリティが、頭蓋骨や長管骨の微細形態に反映しているという作業仮説を検証するために、6週齢を中心に、マウス前頭骨を高解像度Ｘ線ＣＴで経時的に解析した。生後の前頭骨の大部分は皮質骨が１層であり、左右の前頭骨それぞれで、周辺部分から中心に向けて放射状の骨梁が徐々に形成されて２層構造になっていくことが観察された。この放射状骨梁は概ね左右対称であるものの、その対称性は不完全であり、骨芽細胞の偏ったキラリティを反映している可能性が見いだされた。レーザー共焦点顕微鏡を用いた骨芽細胞や破骨細胞、血管のイメージングにより、放射状骨梁の周囲に特徴的な骨芽細胞や破骨細胞の配置が観察された。また別に、成長過程のマウスについて右腓骨の高解像度Ｘ線ＣＴイメージング像を得た。骨小腔を楕円体近似して、各骨小腔の長軸方向と、骨表面骨髄の長軸方向との関係を定量的に評価したところ、皮質骨の特異部分を除き、骨髄側から見て同一方向に傾いている骨小腔が、逆方向に傾いているものよりも有意に多かった。つまり、腓骨の皮質骨にある骨小腔の集団は螺旋様に配置していた。螺旋様構造はキラリティをもつので、左右の長管骨が鏡像か、ホモキラルであるかを判定できる。頭蓋骨と長管骨での形態学的解析基盤を確立できたので、細胞キラリティの偏りと骨形態との関係が明らかにできる見通しが立った。 【トランスペアリング仮説】坐骨神経切除術後のマウス長管骨を用いたＸ線顕微鏡による解析などにより、皮質骨を貫通する管腔構造が、内向きのトランスペアリングで皮質骨内外のコミュニケーションを担っているというデータが得られたので、論文化の見通しが立った。 2023年度は、下記の二つの仮説の検証について論文化に必要十分なデータの収集を目指す。 【細胞キラリティ仮説】新生仔マウスの頭蓋冠や、離乳後の大腿骨・脛骨、耳小骨や蝸牛から初代骨芽細胞を単離する。次に、細胞培養レベルで右手型や左手型というキラリティを検出する手法（Wan et al, 2011, PNAS; Tee et al, 2003, Nat Commun）をさらに改良し、フィブロネクチンを縦600ｘ横300ミクロンの長方形状にガラス面に塗布する。その上で骨芽細胞を培養し、フィブロネクチンでコートされた長方形部分に骨芽細胞が接着して整列するのを待ち、明視野で撮像し、細胞集団として右方向に傾いて配列するもの（右手型と呼ぶ）と左方向に傾くものを定量的に解析する。さらにアクチン線維を蛍光染色して方向を定量する。生体内においても、細胞キラリティを反映する構造の検出を目指す。 【トランスペアリング仮説】マウス腓骨の皮質骨において、骨外膜の骨芽細胞と骨内膜の破骨細胞が皮質骨を挟んで対になっている「外向きのトランスペアリング」と、骨外膜の破骨細胞と骨内膜の骨芽細胞が対になっている「内向きのトランスペアリング」とを区別し、骨の外からの圧迫に応答して骨を変形させる内向きのトランスペアリングのメカニズムを解析する。具体的には、高解像度ナノCT（nano3DX, リガク）やライトシート顕微鏡（Zeiss LSM980）、共焦点顕微鏡（Evident FV3000, Nikon C2）などを用いて、皮質骨を高解像度に撮像し、皮質骨を貫通する血管腔の可視化や、その直径や密度などの定量を行う。坐骨神経切除術を行うと、内向きトランスペアリングが腓骨の骨幹部の全周に広がる。その状態で皮質骨貫通血管も全周性に広がるかどうかを検討する。

In this study, I found that direct contact between osteoclasts and osteoblasts,especially membrane fraction molecule(s) of osteoblasts, is required for the inductionof Ca^<2+>oscillation-independent osteoclastogenesis. Moreover, I revealed that Cot, aseri